/p0001.djvu

			Rozprawa doktorska 
– 
Grażyna Kurzawińska 
Strona 
1 
z 
122 
Mgr biol. Grażyna Kurzawińska 
Polimorfizm genów warunkujących trombofilię wrodzoną w 
grupie kobiet z poronieniami w I trymestrze ciąży 
Rozprawa doktorska 
Pracownia Biologii Molekularnej 
w Klinice Perinatologii i Chorób Kobiecych 
Uniwersytetu 
Medycznego im. Karola Marcinkowskiego 
w Poznaniu 
PROMOTOR: dr hab. n. med. 
Agnieszka Seremak 
- 
Mrozikiewicz 
Poznań 2008
		

/p0002.djvu

			Panż dr hab. n. med Agnżeszce Seremak-Mrozżkżewżcz 
za okazaną życzlżwość, wyrozum żałość ż pomoc 
oraz 
Panu Pro! dr hab. n. med Krzysztofowż Drewsowż 
Panu dr hab. med n. Przemysławowż M Mrozżkżewżczowż 
za cenne uwagż udzżelone w trakcże badań 
.. . ... . 
l plsama nznIejSze] pracy 


Serdecznże dzżękuję 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 2 z 122
		

/p0003.djvu

			Spis treści 


SP IS TRE Ś CI ................................................................................................................................................. 3 
WYKAZ S TOSOW ANY CH SKRÓTÓW ................................................................................................... 5 
1. W S TĘP ....................................................................................................................................................... 7 
1.1. FIZJOLOGICZNE ZMIANY UKŁADU HEMOSTAZY ZACHODZĄCE W CIĄŻY ................................................... 10 
1.2. ZMIANY w UKŁADZIE KRZEPNIĘCIA POPRZEDZAJĄCE UTRATĘ CIĄŻy........ ............... ................. .............. 14 
1.3. TROMBOFILIE .............................................................................................................................. ............ 15 
1.3.1. Trombofilie wrodzone.............. ............... ............... ............... ................. ............... ................. .............. 15 
1.3.1.1. Mutacj a Leiden czynnika V krzepnięcia........................................................................................... 16 
1.3.1.2. Protrombina......... ................. ............... ................. ............. ................. ............... ................. .............. 19 
1.3.2. Reduktaza mety 1enotetrahydrofolianowa............... ................. ............... ............... ............... ................ 22 


2. CE L PRACy............................................................................................................................................ 28 
3. MATERIAL I ME TO D YKA .................................................................................................................. 29 
3.1. CHARAKTERYSTYKA GRUP BADANYCH ...... ............... ................. ............... ............... ............... ................ 29 
3.2. METODYKA ................ ............... ................. ............... ................. ............... ................. ............... .............. 33 


4. WYNIKI................................................................................................................................................... 42 
4.1. CHARAKTERYSTYKA DANYCH KOBIET Z BADANYCH GRUP ......................................................................42 
4.2. CZĘSTOŚĆ WYSTĘPOWANIA POLIMORFIZMÓW GENÓW WARUNKUJĄCYCH WRODZONĄ TROMBOFILIĘ W 
GRUPIE KOBIET Z DWOMA I WIĘCEJ PORONIENIAMI ORAZ W GRUPIE KONTROLNEJ ..........................................43 
4.3. CZĘSTOŚĆ WYSTĘPOWANIA POLIMORFIZMÓW BADANYCH GENÓW W GRUP ACH KOBIET Z DWOMA ORAZ 
TRZEMA I WIĘCEJ PORONIENIAMI................................................................................................................... . 50 
4.4. ZWIĄZEK BADANYCH WARIANTÓW GENETYCZNYCH Z WYSTĄPIENIEM PORONIEŃ WE WCZESNYM I PÓŹNYM 
OKRESIE I TRyMESTRU..................................................................................................................... .............. 54 
4.5. WSPÓŁWYSTĘPOWANIE GENOTYPÓW CZYNNIKA V LE IDE N ORAZ 2021 OG>A PROTROMBINY W GRUPIE 
KOBIET Z DWOMA I WIĘCEJ PORONIENIAMI ORAZ W GRUPIE KONTROLNEJ ...................................................... 59 
4.6. WSPÓŁWYSTĘPOWANIE GENOTYPÓW 677C>T, 1298A>C I 1793G>A W GRUPIE KOBIET Z DWOMA I WIĘCEJ 
PORONIENIAMI ORAZ W GRUPIE KONTROLNEJ.... ............... ................. ............... ............... ............... ................ 60 
4.7. PORÓWNANIE CZĘSTOŚCI WYSTĘPOWANIA HAPLOTYPÓW GENU MTHFR W GRUPIE KOBIET Z DWOMA I 
WIĘCEJ PORONIENIAMI ORAZ W GRUPIE KONTROLNEJ..................................................................................... 61 


5. D YS KU SJ A .............................................................................................................................................. 63 
5.1. POLIMORFIZMY GENÓW CZYNNIKA V I PROTROMBINY JAKO CZYNNIKI RYZYKA WYSTĘPOWANIA PORONIEŃ 
NAWRACAJĄCyCH................................................................................................................. ......................... 64 
5.1.1. Czynnik V Leiden ... ................. ............... ................. ............. ................. ............... ................. .............. 64 
5.1.2. Polimorfizm 20210G>A genu protrombiny .........................................................................................73 
5.2. POLIMORFIZMY GENU MTHFR JAKO CZYNNIK WYSTĘPOWANIA PORONIEŃ NAWRACAJĄCyCH............... 76 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 3 z 122
		

/p0004.djvu

			5.2.1. Homocysteina i jej przemiany biochemiczne w organizmie................................................................76 
5.2.2. Polimorfizmy genu MTHFR .... ............... ............... ............... ................. ............... ................. .............. 81 
5.2.2.1. Polimorfizm 677C>T genu MTHFR.... ............... ................. ............... ............... ............... ................ 81 
5.2.2.2. Polimorfizm 1298A>C genu MTHFR.. ............... ................. ............... ............... ............... ................ 85 
5.2.2.3. Polimorfizm 1793G>A genu MTHFR . ................. ............. ................. ............... ................. .............. 87 
5.3. INNE PRZYCZYNY TROMBOFILII WRODZONEJ WPŁYWAJĄCE NA WYSTĘPOWANIE UTRATY CIĄŻy............. 88 
5.3.1. Niedobór anty trombiny III..... ................. ............... ................. ............... ................. ............. ................ 89 
5.3.2. Wrodzone niedobory białek C i S ........................................................................................................90 
5.4. POLIMORFIZMY INNYCH GENÓW WŁĄCZONYCH W KASKADĘ KRZEPNIĘCIA I ICH ZWIĄZEK Z WYSTĘPOWANIEM 
PORONIEŃ....................................................................................................................... ................................ 91 
5.5. OGÓLNE ZASADY PROFILAKTYKI PRZECIWZAKRZEPOWEJ U CIĘŻARNYCH Z TROMBOFILIĄ WRODZONĄ... 96 
5.6. PODSUMOWANIE................................................................................................................... ................. 10l 


6. WNIO S KI ............................................................................................................................................... 102 
7. S TRE S ZC ZE NIE ................................................................................................................................... 103 
8. SUMMARy............................................................................................................................................ 106 
9. P IŚ MIE NNI CTW O ............................................................................................................................... 109 
10. SPIS TABEL, RYCIN I FOTOGRAFII ............................................................................................ 121 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 4 z 122
		

/p0005.djvu

			WYKAZ STOSOWANYCH SKRÓTÓW 


aCL 
ALL 
APC 
APCR 
APS 

2GPI 
CRL 
CBS 
DNA 
DVT 
EDTA 
EPCR 
ER 
F 
FAD 
FSAP 
Fb 
FDP 


FYL 
Hcy 
HCTL 
HDL 
HHcy 
HLA 
HPLC 


ICSI 


IUGR 


LA 
LD 
LDL 
LOD 
MTHFR 


mRNA 
NADPH 


OD 
P ABP II 
P AI-I 
P AI-2 
PCI 


przeciwciała antykardiolipinowe (ang. antżcardżolżpżn antżbodżes) 
ciężka białaczka limfoblastyczna (ang. acute lymphoblastżc leukemża) 
aktywne białko C (ang. actżvated proteżn C) 
oporność na aktywowane białko C (ang. actżvated proteżn C resżstance) 
zespół antyfosfolipidowy (ang. antżphospholżpżd syndrome) 
beta2-g1ikoproteina I (ang. /32-glycoproteżn 1) 
długość ciemieniowo- siedzeniowa (ang- crown- rump length) 

-syntaza cysteationiny (ang. cystathżonżne jJ-synthase) 
kwas dezoksyrybonukleinowy (ang. deoxyrżbonucleżc acżd) 
zakrzepica żył głębokich (ang. deep veżn thrombosżs) 
kwas etylenodiaminotetraoctowy (ang. ethylene dżamżne tetraacetżc acżd) 
receptor białka C (ang. endothelżal proteżn C receptor) 
retikulum endoplazmatyczne (ang. endoplasmżc retżculum) 
czynnik (ang.factor) 
dinukleotyd flawinoadeninowy (ang.jlavżn adenżne dżnucleotżde) 
proteza aktywująca czynnik VII (ang.factor VII -actżvatżng protease) 
fibrynogen, czynnik I (ang.fibrżnogen) 
produkty degradacji fibrynogenui fibryny (ang. fibrżn degradatżon 
products) 
mutacja 1691G>A czynnika V (Leiden) (ang.factor V Leżden) 
homocysteina (ang. homocysteżne) 
tiolakton homocysteiny (ang. homocysteżne thżolactone) 
lipoproteiny o dużej gęstości (ang. hżgh-densżty Iż po pro też n) 
hi perhomocysteinemia (ang. hyperhomocysteżnemża) 
ludzkie antygeny leukocytarne (ang. human leukocyte antżgens) 
wysokosprawa chromatografia cieczowa (ang. hżgh performance lżqużd 
chromatography ) 
docytoplazmatyczna iniekcja plemników (ang. żntracytoplasmżc sperm 
żnjectżon). 
wewnątrzmaciczne ograniczenie wzrastania płodu (ang. żntrauterżne 
growth retardatżon) 
antykoagulant toczniowy (ang. lupus antżcoagulant, lupus antżbody) 
nierównowaga sprzężeń (ang. lżnkage dżsequżlżbrżum) 
lipoproteiny o małej gęstości (ang. low densżty lżpoproteżn) 
logarytm szans (ang. logarżthm ofthe odds) 
reduktaza 5, 10-metylenotetrahydrofolianu (ang.5, 10- 
methylenetetrahydrofolate reductase (NADPH)) 
matrycowy RNA (ang. messanger RNA) 
dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy (ang. nżcotżnamżde adenżne 
dżnucleotżde phosphate 
gęstość optyczna (ang. optżcal densżty) 
białko wiążące sekwencj ę poli A (ang. poly-A bżndżng pro też n ) 
inhibitor fibrynolizy typu-l (ang. plasmżnogen actżvator żnhżbżtor type-1) 
inhibitor fibrynolizy typu-2 (ang. plasmżnogen actżvator żnhżbżtor type-2) 
inhibitora białka C (ang. proteżn C żnhżbżtor) 


Strona 5 z 122 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska
		

/p0006.djvu

			PCR 
PON 
Prou-P A 
PTM 
pz 
RFLP 


RM 
RNA 
SAM 
SAR 
SNP 


TF 
tHcy 
TM 
tPA 
uPA 
UTR 
VTE 
WHO 
WR 


polimerazowa reakcj a łańcuchowa (ang. polymerase chażn reactżon) 
paraoksonaza(ang.paraoxonase) 
prourokinaza (ang. prourokżnase) 
mutacja 20210G>A genu protrombiny (ang. prothrombżn mutatżon) 
par zasad (ang. base pażr, bp) 
polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych (ang. restrżctżon 
Jragments length polymorphżsmj 
poronienia nawracające (ang. recurrent mżscarrżage) 
kwas rybonukleinowy (ang. rżbonucleżc acżd) 
S-adenozylometionina (ang. S-adenosylmethżonżne) 
S-adenozylhomocysteina (ang. S-adenosylhomocysteżne) 
polimorfizm pojedynczego nukleotydu (ang. sżngle nucleotżde 
polymorphżsm) 
czynnik tkankowy (ang. tżssue Jactor) 
homocysteina całkowita w osoczu (ang. to tal plasma homocysteżne) 
trombomodulina (ang. thrombomodulżn) 
tkankowy aktywator plazminogenu (ang. tżssue plasmżnogen actżvator) 
urokinaza (ang. urokżnase) 
nietranslowane sekwencje w mRNA (ang. untranslated regżon) 
żylna choroba zakrzepowo- zatorowa (ang. venous thromboembolżsm) 
Światowa Organizacja Zdrowia (ang. World Health Organżzatżon) 
współczynnik ryzyka, iloraz szans (ang. odds ratżo) 


Strona 6 z 122 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska
		

/p0007.djvu

			l. WSTĘP 


Poronieniem (abortus) nazywamy przedwczesne zakończenie ciąży na skutek wydalenia 
jaja płodowego z macicy do 22 tygodnia czasu jej trwania. Sytuacja ta należy do 
naj częstszych powikłań ciąży. Częstość występowania poronień samoistnych ocenia się na 
około 15% wszystkich rozpoznawanych ciąż. Dokładna ocena liczby wczesnych poronień 
samoistnych nie jest możliwa, gdyż już w 1975 roku Roberts i Lowe opublikowali pracę, w 
której używając matematycznego modelu zasugerowali, że 75% ciąż u człowieka ulega 
poronieniu w bardzo wczesnym okresie [Roberts i Lowe, 1975; Bartel, 2007]. 
Poronienia mogą być spowodowane różnymi czynnikami zależnymi od matki lub jaja 
płodowego. Odpowiedzialne za nie są nieprawidłowości chromosomalne, zaburzenia 
hormonalne, zmiany anatomiczne dróg rodnych kobiety, w tym w szczególności wady 
macicy, czynniki immunologiczne. Dużą rolę w patomechanizmie tego powikłania 
przypisuje się także występowaniu chorób ogólnoustrojowych (niedoczynność tarczycy) 
oraz różnym infekcjom (różyczka, opryszczka, cytomegalia, toksoplazmoza, listerioza). 
Czynnikiem ryzyka wystąpienia poronień jest również nadmierne spożycie alkoholu oraz 
wiek matki (zdecydowanie wyższy procent utraty ciąży po 38 r.ż.) [Skrzypczak, 2006]. 
Objawy kliniczne poronienia to głównie krwawienie z macicy o różnym stopniu nasilenia, 
nieraz ze skrzepami krwi oraz towarzyszącymi skurczami o zmiennym natężeniu. Objawy te 
mogą wystąpić nawet kilka dni po obumarciu zarodka [Skrzypczak, 2005]. 
Zachowania reprodukcyjne w dzisiejszym społeczeństwie ulegają zmianom i wiele 
kobiet obecnie odkłada zaj ście w ciążę na później szy okres życia. Według danych 
statystycznych w Wielkiej Brytanii ilość dzieci urodzonych przez matki w wieku 35 lat lub 
więcej podwoiła się w latach 1985 - 2001 z 8% na 16% wszystkich urodzeń. Chociaż nie ma 
tutaj ścisłych danych na temat poronień, logicznym jest wniosek, że stosunek poronień także 
wzrósł. Niewątpliwie wiek matki w chwili poczęcia jest silnym, niezależnym czynnikiem 
ryzyka poronienia spowodowanym wzrostem nieprawidłowości chromosomalnych u płodu. 
Ryzyko utraty ciąży wzrasta gwałtownie po 35 roku życia, od 8,7% w wieku 22 lat do 
84, 1% w wieku 48 lat i więcej. Szansa na pomyślne zakończenie ciąży u kobiet w wieku 40 
lat i więcej jest mała i może wiązać się z ryzykiem poronienia, wystąpieniem ciąży 
ektopowej lub obumarciem wewnątrzmacicznym płodu dużo większym niż u kobiet w 
wieku 30 lat [Nybo i wsp., 2000]. 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 7 z 122
		

/p0008.djvu

			Wywiad położniczy jest drugim bardzo ważnym i niezależnym czynnikiem prognozującym 
rezultat przyszłej ciąży. Pierwiastki i wieloródki, u których w wywiadzie potwierdzono ciążę 
zakończoną urodzeniem zdrowego dziecka, mają niższe ryzyko występowania poronienia 
niż kobiety, których poprzednie ciąże zakończyły się niepowodzeniem. Zarówno badania 
retrospektywne, jak i prospektywne wykazują, że ryzyko poronienia wzrasta po każdej 
kolejnej utracie ciąży, osiągając 45% po trzech następujących niepowodzeniach. Ten wzrost 
można częściowo tłumaczyć starszym wiekiem kobiety przy kolejnej próbie donoszenia 
ciąży [Rai i Regan, 2006]. 
Wyniki badań dotyczących wpływu środowiska na ciążę są sprzeczne i trudne do 
interpretacji. Brak jest również dokładnych danych na temat ekspozycji i dawki toksyn. 
Pewne czynniki środowiskowe uznane są jednak za szkodliwe dla wyniku ciąży. Palenie 
papierosów ma szkodliwy wpływ na funkcjonowanie trofoblastu i jest związane z zależnym 
od dobowej dawki nikotyny wzrostem ryzyka wystąpienia poronienia. Niezależnym 
czynnikiem utraty ciąży jest stosowanie kokainy. Alkohol ma szkodliwy efekt na płodność i 
rozwój płodu: nawet umiarkowana konsumpcja 3-5 jednostek na tydzień podnosi ryzyko 
wystąpienia poronienia. Spożywanie kofeiny jest również zależną od dawki przyczyną 
wzrostu ryzyka wystąpienia poronienia, szczególnie kiedy dawka przekracza 300 mg (ok. 
trzech filiżanek) kawy dziennie [Kesmodel i wsp., 2002, Henriksen wsp., 2004, Rasch, 
2003]. Również wśród niektórych grup zawodowych odnotowano wzrost częstości 
występowania poronień. Prawdopodobieństwo poronienia wzrasta u kobiet, które w okresie 
okołoporodowym przyjmowały niesteroidowe leki przeciwzapalne lub leki antydepresyjne. 
Ważnym czynnikiem sprzyjającym niemożności donoszenia ciąży, poronieniom oraz 
komplikacjom w późniejszej ciąży jest również otyłość [Lashen i wsp., 2004, Sebire i wsp., 
2001]. 
Gdy mamy do czynienia z więcej niż trzema następującymi po sobie poronieniami w jednym 
związku partnerskim według definicji Światowej Organizacji Zdrowia (WHO - ang. World 
Health Organżzatżon) możemy uznać je za poronienia nawracające (1-2% wszystkich ciąż). 
Natomiast już wystąpienie dwóch następujących po sobie poronień w wywiadzie powinno 
skłaniać do rozszerzenia diagnostyki u kobiet dotkniętych tym powikłaniem. 
Wystąpienie poronień nawracających u kobiet jest dużym problemem medycznym i 
społecznym. Kobiety dotknięte tym powikłaniem powinny być objęte szczególną opieką, nie 
tylko medyczną, ale także psychologiczną. W tym aspekcie bardzo ważna jest identyfikacja 
czynników ryzyka wystąpienia poronienia celem podniesienia standardów opieki prenatalnej 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 8 z 122
		

/p0009.djvu

			w następnej ciąży i urodzenia zdrowego, donoszonego noworodka. Z tego względu 
przeprowadza się badania genetyczne kariotypu obydwojga rodziców (wykluczenie 
zrównoważonej strukturalnej anomalii chromosomów), badania genetyczne kosmówki lub 
zarodka (wykluczenie aneuploidii lub poliploidii, jako przyczyny poronień), jak również 
badania mające na celu wykluczenie wad anatomicznych maCICY (badanie 
ultrasonograficzne, histerosalpingografia, histeroskopia, laparoskopia). Podejmuje się także 
ocenę hormonalną prawidłowej czynności ciałka żółtego. Oprócz tego wskazane jest 
przeprowadzenie testów w kierunku obecności Chlamydża trachomatżs, mykoplazm oraz 
współwystępowania waglllOZY bakteryjnej. Cenne jest także przeprowadzenie 
szczegółowego wywiadu internistycznego, oznaczenie udziału czynnika immunologicznego 
- przeciwciał antyfosfolipidowych (antykoagulant tocznia, antykardiolipina), rozważenie 
wykonania oceny antygenów HLA klasy I oraz II obecności przeciwciał 
przeciwplemnikowych. Coraz częściej uważa się, że przyczyną poronień nawracających 
mogą być także zaburzenia układu krzepnięcia matki prowadzące do wystąpienia zmian 
zakrzepowych uwarunkowanych wystąpieniem trombofilii wrodzonej lub nabytej. Obecnie 
w przypadku poronień nawracających poszerzeniem diagnostyki jest także oznaczenie 
obecności przeciwciał antyfosfolipidowych, mutacji w genach biorących udział w procesach 
krzepnięcia fibrynolizy oraz niedoboru endogennych inhibitorów krzepnięcia 
[Rekomendacje PTG, 2005 i 2008]. 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 9 z 122
		

/p0010.djvu

			1.1. Fizjologiczne zmiany układu hemostazy zachodzące w ciąży 


Nosicielstwo trombofilii wrodzonej ma szczególne znaczenie u kobiet ciężarnych, u 
których zmiany w układzie krzepnięcia i fibrynolizy pojawiające się w przebiegu ciąży 
predysponują do wystąpienia zmian zakrzepowych. Okres ciąży jest związany z dużymi 
zmianami w organizmie matki, m.in. wzrasta aktywność większości czynników krzepnięcia, 
natomiast zmniejszeniu ulegają niektóre naturalne antykoagulanty obserwuje się także 
ograniczenie aktywności fibrynolitycznej. Tak więc ciąża sama w sobie jest okresem 
związanym znadkrzepliwością. 
W okresie ciąży następuje ogólny wzrost potencjału krzepnięcia, naj silniej zaznaczony w 
trzecim trymestrze ciąży, co z jednej strony zabezpiecza przed nadmiernym krwawieniem w 
okresie porodu, ale z drugiej zwiększa możliwość wystąpienia zakrzepicy i zaburzeń 
naczyniowych w krążeniu maciczno - łożyskowym. Z punktu widzenia zmian hemostazy 
ciążę można określić, jako stan ciągłej gotowości do wykrzepiania wewnątrznaczyniowego, 
zlokalizowanego głównie w łożysku [Bręborowicz i Sobieszczyk, 2005]. 
Trofoblast oddziałuje na układ krzepnięcia i fibrynolizy matki. Powstające w mm 
prokoagulanty i inhibitory fibrynolizy przedostają się do krwi matki wraz z krwią 
odpływającą z przestrzeni międzykosmkowej. Stan nadkrzepliwości wywołuje czynnik 
tkankowy (TF ang. tżssue Jactor) uwalniany z trofoblastu, natomiast względne zahamowanie 
fibrynolizy jest skutkiem działania łożyskowego inhibitora fibrynolizy typu-2 (P AI-2 ang. 
plasmżnogen actżvator żnhżbżtor type-2) oraz naczyniowego inhibitora fibrynolizy typu-l 
(PAl-l). Niedobór lokalnego antykoagulanta w łożysku - aneksyny V, może być powodem 
wieloogniskowej zakrzepicy w łożysku i wewnątrzmacicznego ograniczenia wzrastania 
płodu (IUGR ang. żntrauterżne growth retardatżon) [Uszyński, 2003]. 
Fibrynogen (Fb, czynnik I) to główny substrat trombiny, z którego powstaje fibryna 
wzmacniająca pierwotny czop płytkowy. Jego stężenie wzrasta w czasie ciąży i zmiany te są 
obserwowane już od pierwszego trymestru. Wzrasta także stężenie prawie wszystkich 
osoczowych czynników krzepnięcia krwi, tj. przede wszystkim czynników (F ang. Jactor) 
VII, VIII, X, XII, XIII. Wraz ze wzrostem FVIII rośnie stężenie czynnika von Willebranda 
(vWb), który występuje w osoczu w stechiometrycznym kompleksie z czynnikiem VIII. 
Stosunkowo najmniej wzrasta stężenie protrombiny (FIl) oraz czynnika V i IX [Stirling i 
wsp., 1984]. Czynnik XI jest jedynym czynnikiem nie podlegającym zmianom lub, jak 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 10 z 122
		

/p0011.djvu

			wykazują niektóre badania, ulega nawet niewielkiemu obniżeniu do wartości 60-70% 
[Jastrzębska, 2005, Bremme, 2003]. 
Aktywacja czynników krzepnięcia w okresie okołoporodowym łączy się ze wzrostem ilości 
fragmentów protrombiny FI +2, kompleksów trombina - antytrombina III i fibrynopeptydu A 
wskazując na tworzenie trombiny z protrombiny, przy udziale czynnika Xa. Wzrasta także 
stężenie D-dimerów, markerów działania trombiny i plazminy. Zjawisko to spowodowane 
jest przez przedostający się z łożyska do krwi matki czynnik tkankowy. Fizjologiczna 
nadkrzepliwość związana ze wzrostem czynników krzepnięcia krwi podczas ciąży 
fizjologicznej ulega normalizacji po porodzie, poziom wszystkich czynników krzepnięcia 
powraca do wartości referencyjnych w 5-8 tygodniu połogu [Jastrzębska, 2005]. 
Poziom endogennego inhibitora krzepnięcia, antytrombiny III nie zmienia się podczas ciąży. 
Stężenie i aktywność białka C pozostają stałe, lecz następuje osłabienie naturalnego systemu 
antykoagulacyjnego szlaku przemian białka C. Jest to związane z następującą w prawidłowej 
ciąży znaczącą redukcją aktywności białka S. Białko S występuje w osoczu w dwóch 
formach: funkcjonalnie aktywnego, wolnego białka S i białka S związanego ze składową 
komplementu C4b. Ta druga forma jest funkcjonalnie nieaktywna dopóki nie nastąpi 
interakcja z aktywnym białkiem C. W okresie okołoporodowym bardzo często występuje 
oporność na aktywowane białko C (APCR ang. actżvated proteżn C resżstance). Występuje 
ona u ok. 11% kobiet z ciążą fizjologiczną i najczęściej oporność ta jest nabyta, niezależna 
od występowania mutacji Leiden czynnika V krzepnięcia krwi. Uważa się, że główną 
przyczyną rozwoju defektu APCR w ciąży są: postępująca redukcja stężenia inhibitora 
białka C (PCI ang. proteżn C żnhżbżtor) i inhibitora kompleksu trombina-trombomodulina 
oraz obecność przeciwciał antyfosfolipidowych [Jastrzębska, 2005, Kopeć i wsp., 2002]. 
W ciąży zaznacza się również znaczne osłabienie aktywności fibrynolitycznej układu 
hemostazy. Jest to spowodowane głównie przez syntetyzowany przez łożysko i komórki 
mięśniowe macicy inhibitor aktywacji plazminogenu typu 2, który jest obecny w znaczących 
ilościach w surowicy kobiet ciążarnych. Wywodzący się ze śródbłonka inhibitor aktywacji 
plazminogenu (P Al-l) także wzrasta podczas ciąży w przybliżeniu trzykrotnie [Wright i 
wsp., 1988]. Plazminogen wzrasta w ciąży, tak samo jak antyplazmiana i aktywator 
tkankowy plazminogenu, który produkowany jest w śródbłonku. Poziom aktywowanego 
przez trombinę inhibitora fibrynolizy (TAPI ang. trombżn-actżvated fibrynolytżc żnhżbżtor) 
także wzrasta umiarkowanie w czasie ciąży, ale nie wykazuje on odwrotnej korelacji z 
poziomem D-dimerów. Uwalnianie całkowitego tkankowego aktywatora plazminogenu (t- 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 11 z 122
		

/p0012.djvu

			PA ang. tżssue plasmżnogen actżvator) jest natomiast znacząco zmmejszone w ciąży. 
Wszystkie te zmiany powodują u matki wzrost krzepliwości krwi w okresie 
okołoporodowym. 
W ostatnim trymestrze ciąży wzrasta ilość produktów degradacji fibrynogenu, co jest 
wykładnikiem fibrynolizy, ale stanowi też odzwierciedlenie zjawiska depozycji fibryny w 
bogato unaczynionej tkance endometrium i łożyska, która umożliwia utrzymanie 
integralności naczyń. Jest to proces, dzięki któremu ustrój matki przygotowywany jest do 
oddzielenia się łożyska po porodzie [Bręborowicz i Sobieszczyk, 2005]. 
Na tle opisanych powyżej zmian w przebiegu ciąży powodujących wzrost wykrzepiania, 
obecność mutacji w genach kodujących czynniki krzepnięcia dodatkowo może nasilać 
skłonności do powstawania zmian zakrzepowych i być przyczyną poronień nawracających. 
Na ryc. l A i B pokazano naj częstsze mutacje wpływające na procesy hemostazy i związane 


z poromemaml. 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 12 z 122
		

/p0013.djvu

			A) 


KASKADA KRZEPNIĘCIA 


szla k WEwnątrzp m:hodny 


szla k zEwnątrzpm::h odny 


XII ,. Xlla VII > Vlla+TF 
t 
XI > Xla 
t 
IX >- IXa+Vllla 


R505Q 
Xa+Va H1299R (R2) 
V 
t 


X 


protrombina 
20210G>A 


)I trombina 

 
fibrynogEn ). fibryna 
-455G>A ! 
-14BC>T 
> Xllla > skrzEp fibrynovvy 


XIII 
V34L 


B) 


Ryc.1. Schemat kaskady krzepnięcia krwi (A) i układu fibrynolitycznego (B) oraz 
najczęściej występujące mutacje prozakrzepowe (oznaczone kolorem czerwonym) [wg 
Kopeć i wsp., 2002, w modyfikacji własnej]. 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 13 z 122
		

/p0014.djvu

			1.2. Zmiany w układzie krzepnięcia poprzedzające utratę ciąży 


Znany i szczegółowo już opisany jest związek trombofilii wrodzonej z występowaniem 
żylnej choroby zakrzepowo-zatorowej. Mniej natomiast poznanym problemem jest związek 
trombofilii z występowaniem innych powikłań w położnictwie i ginekologii. Udowodniono, 
że takie powikłania położnicze, jak ciężka postać preeklampsji, przedwczesne oddzielenie 
łożyska, ograniczenie wewnątrzmacicznego wzrastania płodu oraz utraty ciąży - poronienia 
nawracające i obumarcie wewnątrzmaciczne w II połowie ciąży przy prawidłowej anatomii 
płodu kojarzą się z występowaniem zakrzepicy w kosmkach łożyska oraz naczyniach 
spiralnych. Powodem tych zmian jest powstanie rozsianej zakrzepicy w naczyniach krążenia 
maciczno-łożyskowego co jest z kolei przyczyną niewystarczającego przepływu przez 
łożysko, zawałów łożyska i jego wtórnej niewydolności. Prawdopodobnie proces ten może 
być bardziej skomplikowany poprzez nakładanie się obecności trombofilii na zmiany w 
zakresie układu hemostazy w przebiegu prawidłowej ciąży. U ciężarnych obserwuje SIę 
bowiem nawet 2-krotny wzrost prawie wszystkich czynników krzepnięcia, a w 
szczególności VII, X, XII, czynnika von Willebranda i fibrynogenu (stosunkowo najmniej 
wzrasta stężenie czynników II, V oraz IX, czynnik XI nie ulega zmianom). Stężenie białka C 
nie zmienia się, natomiast obserwuje się zdecydowany (nawet do 50%) spadek stężenia 
białka S, co wiąże się ze znaczną redukcj ą aktywności całego systemu związanego z 
działaniem aktywowanego białka C [Faught i wsp.,1995]. U kobiet ciężarnych obserwuje się 
również spadek aktywności układu fibrynolizy (przede wszystkim wzrost stężenia inhibitora 
aktywatora plazminogenu typu l oraz typu 2). Zmiany prowadzące do wystąpienia powikłań 
zakrzepowych łatwiej ujawniają się u kobiet nosicielek zmutowanych genów układu 
krzepnięcia (heterozygoty i homozygoty zmutowane). 
Ponadto w kilku badaniach wskazano inne jeszcze zmiany w układzie hemostazy u 
kobiet ciężarnych, u których w później szym okresie nastąpiło poronienie. U kobiet tych w 4- 
7 tyg. ciąży stwierdzono zwiększoną produkcję tromboksanu a pomiędzy 8 oraz 11 tyg. 
ciąży oraz stosunkowy niedobór prostacykliny w porównaniu z kobietami bez utraty ciąży. 
Zmniej szone stężenie prostacykliny i równocześnie zwiększony poziom prozakrzepowego 
czynnika jakim jest tromboksan może prowadzić do wazo spazmu i agregacji płytek w 
trofoblaście powodując mikrozakrzepy i martwicę łożyska [Tulppala i wsp., 1991]. 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 14 z 122
		

/p0015.djvu

			1.3. Trombofilie 


Trombofilią nazywamy wrodzone lub nabyte zaburzenia układu hemostazy, które 
powodują zwiększoną tendencję do powstawania zakrzepów. Termin "tromb ofili a" 
wprowadził Egeberg w 1965 roku dla określenia zwiększonej skłonności zakrzepowej u 
chorego z wrodzonym niedoborem antytrombiny III [Egeberg, 1965]. Powodem wystąpienia 
trombofilii mogą być czynniki genetyczne (trombofilie wrodzone), jak również czynniki 
nabyte. Wymieniane są tu również okoliczności sprzyjające powstawaniu trombofilii, takie 
jak: okres ciąży i połogu, długotrwałe unieruchomienie, stosowanie doustnych środków 
antykoncepcyjnych i hormonalnej terapii zastępczej, otyłość, żylaki, podeszły wiek, 
nowotwory, duże zbiegi chirurgiczne oraz ekstremalny wysiłek fizyczny. 


1.3.1. Trombofilie wrodzone 


Do najczęściej opisywanych przyczyn trombofilii wrodzonych mających udział w 
powikłaniach położniczych należą czynnik V Leiden (ok. 20% powikłań), mutacja 
20210G>A genu protrombiny (ok. 10% powikłań) oraz hiperhomocysteinemia. Mniejsze 
znaczenie mają wrodzone niedobory białek C i S oraz wrodzony niedobór antytrombiny III. 


Tabela l. Naj częstsze wymieniane przyczyny trombofilii wrodzonej. 


4,0-5,0 
Poort i wsp., 1996 1,7-3,0 20210G>A 
Frost i wsp., 1995 8,0-13,0 677C> T 
Griffini wsp., 1981 0,2-0,4 >160 mutacji 
Comp i wsp., 1984 0,2-1,0 > 100 mutacji 
Egeberg i wsp., 1965 0,02 >80 mutacji 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 15 z 122
		

/p0016.djvu

			U kobiet ciężarnych trombofilia wrodzona stwarza potencjalne zagrożenie zarówno żylną 
chorobą zakrzepowo-zatorową jak również powikłaniami położniczymi będącymi skutkiem 
zakrzepów i zawałów w łożysku oraz zmian w tętnicach spiralnych. 


1.3.1.1. Mutacja Leiden czynnika V krzepnięcia 


Czynnik V krzepnięcia krwi (proakceleryna) jest kluczowym białkiem w układzie 
hemostazy. Pełni istotną rolę zarówno w szlaku pro- jak i antykoagulacyjnym. W swojej 
zaktywowanej formie czynnik V (Va) jest kofaktorem czynnika Xa w kompleksie 
protrombinazy, która katalizuje przekształcenie protrombiny w trombinę. W formie 
nieaktywnej FV służy, jako kofaktor dla zaktywowanego białka C w regulowaniu 
aktywności FVIIIa. Przez tą swoją podwójną rolę czynnik V bywa nazywany białkiem o 
"janusowej twarzy" [Nicolaes i wsp., 2002]. 
Prawie 80% czynnika V występuje w osoczu w stężeniu około 20 nM (7 /lg/ml), 
pozostałe 20% zostaj e przechowywane w a-ziarnistościach płytek krwi (4600- 14000 
cząsteczek na płytkę). Czynnik ten zbudowany jest z kilku domen, które można 
schematycznie przedstawić zapisem AI-A2-B-A3-CI-C2. Gen kodujący czynnik V 
krzepnięcia krwi w wyniku hybrydyzacji żn sżtu początkowo zlokalizowany został na 
chromosomie l w pozycji q21-25 [Dahlback i wsp., 1988]. Dalsze badania wykazały jednak, 
że znajduje się on w pozycji Iq23 [McAlpine i wsp., 1989] w sąsiedztwie genu kodującego 
antytrombinę III. 
W 1993 roku Dahlback i wsp. opisali mechanizm nadkrzepiwości spowodowany 
opornością czynników krzepnięcia na działanie naturalnego antykoagulanta, jakim jest 
białko C. Zmiana tajest spowodowana przez punktową mutację w genie kodującym czynnik 
V, nazwaną "czynnik V Leiden" spowodowaną substytucją guaniny adeniną w pozycji 
nukleotydowej 1691, co powoduje zamianę aminokwasu argininy na glutaminę w pozycji 
506 łańcucha białkowego czynnika V. Mutację tę, zlokalizowaną w 10 eksonie genu 
kodującego czynnik V, zidentyfikował w 1994 roku Bertina i wsp. [Bertina i wsp., 1994]. 
Jest to naj częstsza przyczyna trombofilii wrodzonej, wg różnych autorów występująca u 3- 
7% populacji ogólnej. Dziedziczenie mutacji Leiden czynnika V określa się jako 
kodominuj ące. 
System krzepnięcia i układ białka C działają przeciwstawnie. Pierwszy z ich powoduje 
powstawanie nierozpuszczalnej siatki fibryny, podczas gdy drugi hamuje jej tworzenie 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 16 z 122
		

/p0017.djvu

			rozkładając czynnik V oraz VIII. Trombina wiąże trombomodulinę obecną na powierzchni 
komórek śródbłonka i razem aktywują białko C. Zaktywowane białko w obecności kofaktora 
białka S inaktywuje dwa czynniki kaskady krzepnięcia czynniki V/Va i VIII/VIIIa. 


Ryc. 2. Rozkład czynnika V prawidłowego i z mutacją Leiden [wg Leung, 2005]. 


Aby ocenić wpływ obecności czynnika V Leiden na układ krzepnięcia należy zrozumieć 
proces, w którym białko APC inaktywuje czynnik Va. Następuje to przez przecięcie 
cząsteczki czynnika V w trzech osobnych miej scach łańcucha aminokwasowego 
zawierających argininę: w pozycjach 506, 306 i 679. Dla naj szybszej inaktywacji czynnika 
Va, pierwsze przecięcie musi zachodzić w pozycji 506, ponieważ prowadzi to do optymalnej 
ekspozycji dla przecięcia w miejscach 306 i 679. Bez tego szybkiego pierwszego przecięcia 
w miejscu 506 inaktywacja czynnika Va zachodzi w znacząco wolniejszym tempie. 
Ponieważ w przypadku mutacji czynnika V typu Leiden w pozycji 506 arginina zostaje 
zastąpiona glutaminą, aktywne białko C nie jest zdolne do przecięcia czynnika Va w pozycji 
506. Jednakże aktywne białko C nadal może inaktywować czynnik Va przez przecięcie w 
pozycjach 306 i 679, gdzie wbudowane są cząsteczki argininy. Tak więc w obecności 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 17 z 122
		

/p0018.djvu

			mutacji Leiden inaktywacja czynnika Va przez aktywne białko C jest zdecydowanie 
wolniejsza, co prowadzi do wzmożonej generacji trombiny. Badania wskazują także, że 
prawidłowy czynnik V razem z białkiem S służą jako kofaktor dla APC w procesie 
unieczynniania czynnika VIIla. Do tego niezbędne jest również przecięcie czynnika V przez 
APC w pozycji 506, dlatego zmutowany czynnik V Leiden traci tą funkcję kofaktorową i 
następuje wzrost stężenia czynnika Xa. Porównanie działania prawidłowego czynnika V 
oraz czynnika V z mutacj ą Leiden przedstawia ryc. 2. 


Częstość występowania czynnika V Leiden wynosi 4-5% w populacji kaukaskiej 
[Bertina i wsp., 1994; Rees i wsp., 1996]. Czynnik V Leiden powoduje stan nadkrzepliwości 
i zwiększa ryzyko wystąpienia zakrzepicy żylnej 3-7 krotnie u heterozygot oraz aż 80- 
krotnie u nosicieli genotypu homozygotycznego zmutowanego w porównaniu z 
homozygotami typu dzikiego [Rosendaal i wsp., 1995]. Trwałość duża częstość 
występowania tej mutacji w populacji ogólnej sugerują, że może ona powodować 
ewolucyjne korzyści. W 1957 roku amerykański biolog George Williams zaproponował 
hipotezę antagonistycznej plejotropii, która zakłada, że geny przynoszące korzystne efekty u 
osobników młodych mogą równocześnie działać szkodliwie u osobników starszych. 
Ewolucyjne korzyści u kobiet w wieku rozrodczym nosicielek obecności mutacji FVL mogą 
wiązać się z faktem, że tracą one mniej krwi podczas menstruacji, mają wyższy poziom 
hemoglobiny i prawdopodobnie są mniej narażone na zagrażające życiu krwotoki po 
porodzie [Lindqvist i wsp., 2001]. Sugeruje się również, że heterozygotyczni nosiciele FVL 
mogą posiadać korzyści w przypadku ciężkich chorób zapalnych [Kerlin i wsp., 2003]. Z 
drugiej strony jednak mutacja FVL u kobiet może być związana z negatywnymi wynikami 
ciąży takimi jak: poronienia nawykowe, preeklampsja, wcześniactwo i związane z nim 
powikłania. Natomiast w starszym wieku nosiciele FVL narażeni są na zwiększone ryzyko 
wystąpienia chorób zakrzepowych. W 1994 roku Majerus zaproponował hipotezę, że 
obecność FVL ma pozytywny wpływ na implantację. Potwierdza to również badanie Gapel i 
wsp. (2001), w którym zwrócono uwagę, że u kobiet nosicielek mutacji FVL łatwiej 
następował proces implantacji przy zapłodnieniu metodą docytoplazmatycznej iniekcji 
plemników (ICSI ang. żntracytoplasmżc sperm żnjectżon). Badania zapłodnienia żn vżtro 
wykazują 90% powodzeń u nosicielek mutacji FV Leiden i tylko 49% u kobiet z 
prawidłowym genotypem czynnika V [Gap el i wsp., 2001]. Wpływ FVL na reprodukcję u 
mężczyzn jest słabo poznany. Van Dunne i wsp. w badaniu Leiden 85-Plus Study 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 18 z 122
		

/p0019.djvu

			stwierdzili, że mutacja FVL wzmaga płodność u mężczyzn, lecz nie u kobiet. Sugerują oni 
związek genu czynnika V z innym genem, który może powodować wzrost ilości spermy i 
ruchliwości plemników jak również hipotetyzują, że obecność FVL u płodu ułatwia 
implantację u matek nie posiadających tej mutacji [van Dunne i wsp., 2006]. 


1.3.1.2. Protrombina 


Protrombina jest glikoproteiną o masie 72 kDa, syntetyzowaną w wątrobie w obecności 
witaminy K. Jej stężenie w osoczu szacuje się na 100mgil, a czas biologicznego półtrwania 
wynosi około 30 godzin. Przed wydzieleniem do osocza protrombina jest poddawana 
potranslacyjnej modyfikacji z udziałem zależnej od witaminy K karboksylazy, która 
przekształca w rejonie N-końcowym polipeptydu 10 specyficznych reszt glutaminianu w y- 
karboksyglutaminiany. Wytworzone y-karboksyglutaminiany są zlokalizowane w obrębie 
pierwszych 40 aminokwasów dojrzałego białka i wiążąc jony wapnia przyczyniają się do 
możliwości wiązania protrombny do negatywnie naładowanych błon fosfolipidowych płytek 
krwi. 
Protrombina zawiera dwa regiony wewnętrznej homologii nazwane strukturami "kringle". 
Te regiony o charakterystycznej strukturze drugorzędowej są zlokalizowane pomiędzy 
resztami 40 i 270 dojrzałego białka osoczowego i zastępują domeny czynnika wzrostu 
znaj dowane w kilku innych osoczowych protezach serynowych. 
Tak więc chociaż ich dokładna funkcja nie jest znana to sugeruje się, że mogą one pełnić 
rolę w jednej z kilku wzajemnych oddziaływań protrombiny z innymi białkami. Dojrzałe 
jednołańcuchowe białko krąży w osoczu jako zymogen i podczas krzepnięcia jest 
proteolityczni e aktywowane do silnej proteazy serynowej a-trombiny. Aktywacja 
protrombiny do trombiny zachodzi na powierzchni zaktywowanych płytek I wymaga 
obecności kompleksu protrombinazy, składającego się z płytkowych anionowych 
fosfolipidów, jonów wapnia, czynnika Va oraz czynnika Xa. Utworzenie trombiny powoduje 
rozkład fibrynogenu i powstanie fibryny, głównego składnika skrzepu krwi. Podczas 
aktywacji, ludzka protrombina jest przecinana w dwóch miejscach Arg273-Thr274 i 
Arg323-Ser324 tworząc "pro" fragment (fragment 1.2) i trombinę, która jest złożona z 
dwóch łańcuchów połączonych wiązaniem dwusiarczkowym. 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 19 z 122
		

/p0020.djvu

			Gen kontrolujący syntezę protrombiny zlokalizowany jest na chromosomie 11 i zawiera 
14 eksonów, 13 intronów oraz sekwencje niekodujące (UTR ang. untranslated regżon) na 
końcach 5' i 3'. Jednonuklotydowa tranzycja guaniny na adeninę w pozycji 20210 
(numeracja zgodna z Degen i wsp., 1987) zlokalizowana w części eksonu 14 kodującego 
regionu mRNA 3'UTR protrombiny, opisana po raz pierwszy przez Poorta i wsp. (1996) 
powoduje wzrost stężenia białka w surowicy krwi nawet do 20%, co wpływa na wzmożoną 
aktywność układu krzepnięcia i powstanie zakrzepicy [Poort i wsp., 1996]. Mutacja ta 
opIsywana w literaturze skrótem PTM (PTM - ang. prothrombżn mutatżon) jest 
zlokalizowana 20 nukleotydów poniżej sygnału poliCA) i 20 nukleotydów powyżej 
sekwencji U-bogatej końca 3'. Jest to miejsce gdzie pre-mRNA jest endonuklotycznie 
przecinany i poliadenylowany [Gehring i wsp., 2001]. 
Gehring i wsp. (2001) udowodnili, że mutacja genu protrombiny 20210G>A nie wpływa 
na ilość powstającego pre-mRNA, miejsce rozcięcia przez endonukleazę na końcu 3' lub 
długość ogona poliCA) dojrzałego mRNA. Nukleotyd, do którego polimeraza poliCA) dodaje 
ogon poliA jest adeniną, często poprzedzony cytozyną [Sheets i wsp., 1990]. W 
prawidłowym genie protrombiny sygnał rozcięcia transkryptu przez nukleazę na końcu 3' 
jest mniej efektywny i mutacja 20210G>A reprezentuje mutację typu nabycia funkcji (ang. 
gażn- oj- functżon mutatżon), czyli mutację powodującą łatwiejsze rozpoznanie miejsca 
rozcięcia transkryptu, wydajniejsze tworzenie końca 3' oraz większą akumulację mRNA i 
wzrost syntezy białka. Ryc. 3 przedstawia schemat lokalizacji sygnału poliCA) w pre-mRNA 
protrombiny wraz ze związanymi czynnikami cięcia i poliadenylacji [Proudfoot i wsp., 
2001]. Wzmocniona efektywność tworzenia końca 3' może wyjaśniać rolę mutacji 
20210G>A w patogenezie trombofilii [Gehring i wsp., 2001]. 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 20 z 122
		

/p0021.djvu

			Ryc. 3. Schemat lokalizacji sygnału poliCA) w pre-mRNA protrombiny wraz z związanymi 
czynnikami cięcia i poliadenylacji [wg Proudfoot, 2001]. 


Mutacja 20210G>A występuje głównie wśród rasy białej, u której naj prawdopodobniej 
pojawiła się po raz pierwszy około 24 000 lat temu [Zivelin i wsp., 2006]. Jednak w 
przeciwieństwie do mutacji czynnika V Leiden, która częściej występuje w Północnej 
Europie, PTM występuje częściej w Europie Południowej, głównie w rejonie 
śródziemnomorskim z wyjątkiem Francji [Rosendaal i wsp., 1998, Leroyer i wsp. 1998]. 
natomiast rzadko spotykana jest wśród populacji azjatyckich i afrykańskich. 
Do chwili obecnej opisano kilka wariantów allelicznych genu protrombiny, głównie 
prowadzących do hypo- lub dysprotrombinemii. Często badany polimorfizm 20210G>A 
tego genu powoduje wzrost stężenia krążącej protrombiny [Castoldi i wsp., 2000] i jest 
drugim z naj częstszych przyczyn występowania wrodzonej trombofilii. Jest on znajdowany 
u około 6% pacj entów choruj ących na żylną chorobę zakrzepowo- zatorową (VTE ang. 
venous thromboembolżsm) i u prawie 20% rodzin z zakrzepicą, jednak ryzyko wystąpienia 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 21 z 122
		

/p0022.djvu

			zakrzepicy u nosicieli wzrasta tylko około 2,7 krotnie. Mutacj a powoduj e także wzrost 
wystąpienia ryzyka chorób tętniczych głównie wśród palaczy [Lane i wsp., 2000]. 
PTM powoduje tylko stan umiarkowanej zakrzepicy [Poort i wsp., 1996; Rosendaal i wsp., 
1997] może jednak wpływać na występowanie niepowodzeń w ciąży, w tym także na 
występowanie poronień. W odróżnieniu od FVL, PTM jest związana z powstawaniem 
zakrzepów zarówno w układzie żylnym [Poort i wsp., 1996], jak i tętniczym [Rosendaal i 
wsp., 1997]. W dodatku wzrost pOZIOmu protrombiny u nosicieli genotypu 
heterozygotycznego może wpływać nie tylko na krzepnięcie osoczowe. Poza tworzeniem 
fibryny, trombina także aktywuj e płytki, komórki mięśni gładkich, fibroblasty, komórki 
mezangialne i makrofagi [Bar-Shavit i wsp., 1992], które to wszystkie elementy obecne są w 
obrębie tkanek łożyska. Ponadto trombina jest zdolna do indukowania odpowiedzi 
komórkowej, jak: proliferacja i chemotaksja. Tak więc wzrost poziomu protrombiny może 
dotyczyć funkcjonowania łożyska wpływając na podstawowe mechanizmy takie jak adhezja 
komórkowa, proliferacja mięśni gładkich i waskulogeneza [Garcia, 1992]. 
Połączenie mutacji FVL i PTM u pacjentów wydaje się zwiększać ryzyko zakrzepicy już 
we wczesnym okresie życia [Adamek i wsp., 1999]. Połączenie mutacji PTM z innymi 
zakrzepowymi polimorfizmami jak również z czynnikami nabytymi jak np. zespołem 
antyfosfolipidowym również dodatkowo zwiększa to ryzyko [Brenner i wsp., 1999b]. 


1.3.2. Reduktaza metylenotetrahydrofolianowa 


Reduktaza 5,10-metylenotetrahydrofolianowa (MTHFR, EC 1.5.1.20) jest kluczowym 
enzymem w metabolizmie folianów oraz niezbędnym w regulacji stężenia metioniny i 
homocysteiny . 
Homocysteina (Hcy) jest aminokwasem siarkowym posiadającym silnie reaktywną grupę 
hydrosulfidową -SH. Powstaje w organizmie poprzez demetylację egzogennej metioniny, 
pochodzącej z białek dostarczanych z dietą (głównie zwierzęcych). Stężenie Hcy w osoczu 
jest uzależnione głównie od diety (metionina, witaminy uczestniczące w przemianach Hcy), 
ale także od aktywności enzymów uczestniczących w tych szlakach oraz nasilenia transportu 
komórkowego metabolitów. 
Dostarczana z pokarmem metionina w wyniku reakcji katabolicznej katalizowanej przez 
S-adenozylotransferazę metioninową (MAT) zostaje przekształcona do S- 
adenozylometioniny (SAM), zwanej aktywnym metylem. SAM służy jako donor grup 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 22 z 122
		

/p0023.djvu

			metylowych w syntezie wielu ważnych dla organizmów substancji (głównie kreatyny, 
choliny, sarkozyny, syntezie kwasów nukleinowych oraz w metabolizmie ksenobiotyków). 
SAM może także ulegać dekarboksylacji dostarczając grupy propyloaminowe do tworzenia 
ważnych dla organizmu poliamidów spermidyny (łącząc się z putrescyną), a następnie 
sperminy. Po oddaniu grupy metylowej przez SAM powstaje S-adenozylohomocysteina 
(SAR). W wyniku hydrolizy tego związku powstaje homocysteina i adenozyna. Reakcję 
katalizuje hydrolaza S-adenozylohomocysteiny (SAHH) i jest ona łatwo odwracalna. 
Chociaż równowaga dynamiczna reakcji katalizowanej przez SAHH mocno przeważa w 
kierunku syntezy SAR, w stosunku do syntezy Hcy, skuteczne metabolizowanie i odciąganie 
Hcy oraz adenozyny przez różne drogi zezwalają na dominację długotrwałej syntezy Hcy. 
Genetyczne lub spowodowane błędami żywieniowymi zaburzenia, które utrudniają 
skuteczne usunięcie produktu Hcy lub adenozyny może powodować załamanie reakcji 
katalizowanej przez SAHH i prowadzić do wewnątrzkomórkowej kumulacji SAR [James i 
wsp., 2002]. Homocysteina może być ponownie metylowana do metioniny w dwóch 
reakcjach. Pierwszą katalizuje syntaza metioniny (MTR), enzym zależny od witaminy B 12 i 
wymagający dostępności folianów oraz w reakcji katalizowanej przez metylotransferazę 
betaino-homocysteinową (BHMT) połączonej z katabolizmem choliny i betainy. Obie 
reakcje są jednokierunkowe. Homocysteina przy udziale 
-syntazy cystationiny (CBS) oraz 
jej kofaktora fosforanu pirydoksylu (czynnej formy witaminy B6) reaguje z Innym 
aminokwasem seryną. Reakcja ta prowadzi do utworzenia cystationiny, z której następnie 
przy udziale liazy cystationinowej może powstawać cysteina, a następnie glutation, lub inne 
metabolicznie czynne związki. Transsulfuracja jest reakcją nieodwracalną i odciąga Hcy z 
cyklu metioninowego. Remetylacja Hcy do metioniny (cykl metioninowy) przeważa nad 
kataboliczną degradacją Hcy (transsulfuracją) z powodu różnicy wartości Km pomiędzy 
syntazą metioninową (MS) i CBS (ryc. 4). Ściana ludzkiej tętnicy nie zawiera enzymu CBS. 


We krwi krążącej najmmejszą część stanowi wolna homocysteina (3%), 75% jest 
związana z białkami (głównie z albuminami), a reszta (22%) występuje w formie dimerów z 
drugą cząsteczką homocysteiny lub Innego aminokwasu posiadającego grupę 
hydrosulfidową. 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 23 z 122
		

/p0024.djvu

			Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 24 z 122
		

/p0025.djvu

			Enzym MTHFRjest białkiem cytoplazmatycznym, homodimerem, składającym się z dwóch 
podjednostek o wielkości ok. 77 kDa. Każda podjednostka zawiera niekowalencyjnie 
związany dinukleotyd flawinoadeninowy (F AD ang. jlavżn adenżne dżnucleotżde). Proteoliza 
enzymu przez trypsynę powoduje przecięcie każdej podjednostki w silnie hydrofilnym 
regionie (Lys-Arg-Arg-Glu-Glu-Asp) na dwie domeny: katalityczną o wielkości 40 kDa i 
regulatorową - 37 kDa. To cięcie enzymu wiąże się z utratą inhibicji MTHFR przez S- 
adenozylometioninę (SAM ang. S-adenosylmethżonżne), lecz nie traci on własności 
katalitycznych [Matthews i wsp., 1984]. Fluorescencyjna hybrydyzacja żn sżtu wykazała, że 
genMTHFR znajduje się na telomerowym końcu chromosomu l w pozycji Ip36.3 [Goyette 
i wsp., 1994]. 
MTHFR redukuje z udziałem NADPH 5,10-metylenotetrahydrofolian do 5- 
metylotetrahydrofolianu, który jest substratem w reakcji rem etyl acj i homocysteiny do 


metioniny (ryc. 5). 
H H 

 
H2 NADPH NADP+ 
I H 
H 
 
> 
c
 I Cłł.z 
I I i- 
¥ N- ¥ 
H 


Ryc. 5. Redukcja 5,10-metylenotetrahydrofolian do 5-metylotetrahydrofolianu z udziałem 
NADPH. 


Całkowity brak aktywności MTHFR występuje bardzo rzadko i prowadzi do ciężkiej 
hiperhomocysteimemii, w której stężenie homocysteiny jest porównywalne z występującym 
w homocysteinurii spowodowanej niedoborem 
-syntazy cysteationiny (CBS ang. 
cystathżonżne jJ-synthase). 
W 1988 roku Kang i wsp. odkryli istnienie tzw. termolabilnego wariantu białka MTHFR. 
Stwierdzili, że ogrzewając ekstrakt limfocytów w temperaturze 46°C przez 5 minut 
charakteryzuje się on zmniejszoną stabilnością oraz że jest przyczyną łagodnej 
hiperhomocysteinemii [Kang i wsp., 1988]. 
Wielkość genu MTHFR wynosi ponad 20 kpz. W roku 1998 opisano [Goyette i wsp., 
1998], że składa się on z 11 eksonów, a w 2000 roku Homberger i wsp. Stwierdzili obecność 
13 eksonów (3 pierwsze ulegają transkrypcji tylko jeden raz w danym białku) [Homberger i 
wsp., 2000]. W ten sposób mogą występować cztery warianty białek MTHFR: MTHFRI (2 
formy), MTHFR2 i MTHFR3. Wszystkie te warianty mają identyczne 3' końce, ale różnią 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 25 z 122
		

/p0026.djvu

			się na końcach 5'. Dwie formy MTHFRI powstają w rezultacie alternatywnego splicingu, 
różnią się występowaniem lub brakiem trzech nukleotydów. Region regulatorowy genu 
MTHFRjest bardzo interesujący. Zawiera on różne elementy promotorowe takie jak: CAAT, 
elementy GC, oraz SPI, API, AP2. Nie występuje natomiast najczęściej opisywany element 
w genach eukariotycznych - sekwencja TATA [Homberger i wsp., 2000]. 
Chociaż stężenie homocysteiny w ciąży spada, to jednak nawet łagodna 
hiperhomocysteinemia jest czynnikiem powodującym wzrost ryzyka wystąpienia zmian 
zakrzepowych. Także stężenie folianów niezbędnych do remetylacji homocysteiny 
zmniejsza się podczas ciąży, co jest spowodowane głównie wzrostem zapotrzebowania na 
foliany przez rosnący płód. 


Polimorfizm 677C>T 


W 1995 roku Frost i wsp. opisał mutację w domenie regulacyjnej genu MTHFR 
powodującą zmianę w białku - wbudowanie waliny w pozycji 222 w miejsce alaniny 
(A222V). Mutacja jest zlokalizowana weksonie czwartym i spowodowana punktową 
tranzycją cytozyny w pozycji 677 na tyminę (677C>1) (ryc. 6). Polimorfizm ten znajduje się 
w miejscu wiążącym kofaktor MTHFR - FAD [Guenther i wsp., 1999]. W jej wyniku 
powstaje termolabilny wariant białka MTHFR o obniżonej aktywności u nosicieli genotypu 
TT do około 30%, genotyp heterozygotyczny CT posiada 60% aktywności enzymu MTHFR 
żn vżtro [Frosst i wsp., 1995]. 


Polimorfizm 1298A>C 


Van der Put i wsp. (1998) zidentyfikowali kolejny polimorfizm w genie MTHFR, w 
pozycji nukleotydowej 1298A>C, powodujący wymianę glutaminianu na alaninę w pozycji 
429 (E429A) białka enzymatycznego (ryc. 6). Podczas gdy tranzycj a 677C> T występuje w 
obrębie domeny katalitycznej enzymu MTHFR, transwersja 1298A>C jest zlokalizowana w 
domenie regulatorowej gdzie następuje wiązanie S-adenozylometioniny. Wiązanie SAM 
powoduje zmiany konformacyjne w białku MTHFR, które inhibitują aktywność enzymu 
[Matthews i wsp., 1984]. Mutacja 1298A>C powoduje obniżenie aktywności MTHFR, która 
jest bardziej wyraźna u homozygot niż u heterozygot. 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 26 z 122
		

/p0027.djvu

			Ryc. 6. Schemat lokalizacji na chromosomie, budowy białka i genu oraz rozmieszczenia 
naj ważniej szych polimorfizmów genu reduktazy metylenotetrahydrofolianowej. 


Polimorfizm 1793G>A 


Polimorfizm występujący w pozycji 1793 powoduje zamIanę guamny na adeninę w 
eksonie 11, co wywołuje zmianę w sekwencji aminokwasowej białka - aminokwas arginina 
(R) zostaje zastąpiony glutaminą (Q) w pozycji 594 (ryc. 6). Sugeruje to, że polimorfizm ten 
może zmieniać strukturę lub funkcję białka. Porównując białko ludzkie z mysim 
stwierdzono, że u myszy w tym miejscu występuje zamiast argininy aminokwas glutamina. 
Ponieważ polimorfizm R594Q jest zlokalizowany w obrębie C-końca peptydu, które to 
miejsce często jest ważne dla stabilizacji białka stąd mutacja ta może wpływać na zmiany w 
aktywności i funkcję reduktazy MTHF. Polimorfizm ten został po raz pierwszy opisany w 
roku 2002 przez Rady i wsp., którzy badali częstość jego występowania w Stanach 
Zjednoczonych u przedstawicieli rasy kaukaskiej, afro-amerykańskiej, hiszpańskiej i żydów 
aszkenazyjskich. Częstość jego występowania jest mniejsza niż mutacji 677C>Ti 1298A>C. 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 27 z 122
		

/p0028.djvu

			2. CEL PRACY 


Celem pracy była ocena częstości występowania oraz znaczema obecności 
polimorfizmów w genach kodujących czynnik II i czynnik V krzepnięcia oraz enzym 
reduktazę metylenotetrahydrofolianową (MTHFR) w grupie kobiet z dwoma lub WIęcej 
poronieniami w I trymestrze ciąży. 


Cel ten realizowano poprzez: 
l. Porównananie częstości występowania w obydwu grupach (kobiet z obecnością dwóch 
lub więcej poronień w I trymestrze ciąży w wywiadzie oraz grupy kontrolnej - zdrowych 
kobiet, bez obecności poronień w wywiadzie u których potwierdzono obecność co najmniej 
jednej prawidłowo rozwijającej się ciąży zakończonej urodzeniem zdrowego, donoszonego 
noworodka) genotypów i alleli następujących polimorfizmów: 
aj Czynnika V Leiden 1691G>A 
bj Czynnika II (protrombiny) 20210G>A 
ej MTHFR 667C>T 
d) MTHFR 1298A>C 
ej MTHFR 1793G>A 
oraz zbadanie zależności pomiędzy ich występowaniem a liczbą poronień oraz tygodniem 
zakończenia ciąży. 
2. Wzajemną korelację genotypów badanych polimorfizmów w grupIe kobiet z 
poronieniami i kontrolnej. 
3. Próbę znalezienia korelacji pomiędzy poszczególnymi polimorfizmami poprzez badanie 
haplotypów a następnie badanie ich wzajemnych powiązań z częstością występowania 
poronień. 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 28 z 122
		

/p0029.djvu

			3. MATERIAŁ I METODYKA 


3.1. Charakterystyka grup badanych 


Badania przeprowadzono w dwóch grupach kobiet: 11 z obciążonym wywiadem w 
kierunku występowania poronień (dwóch lub więcej) w I trymestrze ciąży oraz 21 kobiet, 
które urodziły zdrowe dziecko, u których wykluczono występowanie poronień oraz 
potwierdzono obecność, co najmniej jednej ciąży donoszonej, zakończonej urodzeniem 
zdrowego noworodka. Pacjentki hospitalizowane były w Klinice Perinatologii i Chorób 
Kobiecych Uniwersytetu Medycznego im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu. Badania 
przeprowadzono latach 2006 - 2007. Ciężarne kwalifikowano do badania podczas ich 
pobytu w Klinice, po uprzednim dokładnym zebraniu danych klinicznych, danych na temat 
wykonywanych uprzednio badań diagnostycznych oraz zastosowaniu kryteriów włączenia i 
wyłączenia z badań. 
Wszystkie pacjentki zostały poinformowane o celu i zakresie przeprowadzanych badań 
oraz wyraziły na nie pisemną zgodę. Na przeprowadzenie badań uzyskano zgodę Komisji 
Bioetycznej Uniwersytetu Medycznego w Poznaniu nr 1013/06. 


Grupa badana 


Grupę badaną (104 osoby) (średnia wieku 30,15 ::!: 4,07 lat, zakres 23-40 lat, mediana 30 
lat) stanowiły kobiety z dwoma i więcej poronieniami, które zgodnie z rekomendacjami 
Polskiego Towarzystwa Ginekologicznego z roku 2005 oraz 2008 podlegaj ą poszerzonej 
diagnostyce w kierunku występowania poronień nawracających [Rekomendacje PTG, 2005, 
2008]. Poronienie rozpoznawano jako wydalenie z jamy macicy jaja płodowego i 
zakończenie ciąży przed 22 tygodniem czasu jej trwania. Na podstawie dostępnej 
dokumentacji medycznej upewniano się również, że w przypadku każdej ciąży 
rozpoznawana była obecność echa zarodka. Wiek ciążowy, w którym doszło do poronienia 
określany był na podstawie daty wystąpienia ostatniej miesiączki, analizy regularności cykli 
miesięcznych oraz analizy badań ultrasonograficznych wykonywanych u pacjentki. 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 29 z 122
		

/p0030.djvu

			Kryteria włączenia I wyłączenia - grupa badana: 
l. obecność co najmniej 2 poronień w I trymestrze ciąży w wywiadzie (6 do 13 t.c.), 
2. przynależność do rasy białej (kaukaskiej), narodowość polska, 
3. wykluczenie innych patologii położniczych mogących mieć związek z występowaniem 
powikłań zakrzepowych, 
4. wykluczenie innych przyczyn poronień (nieprawidłowości chromosomalne, zaburzenia 
hormonalne, choroby ogólne matki, zakażenia, wady macicy), 
5. wykluczenie zmiany partnera, 
6. ujemny wynik badania w kierunku obecności przeciwciał antyfosfolipidowych. 
W pracy dwukrotnie podzielono badaną grupę 104 pacjentek na podgrupy. Pierwszy 
podział, który dotyczył ilości występujących poronień, spowodował powstanie dwóch 
podgrup: kobiet z dwoma poronieniami (80 osób) oraz z trzema i więcej poronieniami (24 
osoby). Następnie podzielono pacjentki na trzy podgrupy ze względu na czas wystąpienia 
poronienia. Uzyskane podgrupy zostały oznaczone jako A, u których poronienia wystąpiły 
we wczesnym okresie I trymestru ciąży (6 do 10 tygodnia - 65 osób), B poronienia w 
późniejszym okresie I trymestru (11 do 13 tygodnia ciąży - 16 osób) oraz C (23 osoby), u 
których poronienia występowały zarówno we wczesnym, j ak i późnym okresie I trymestru 
(6-13 tydzień ciąży). 


Grupa kontrolna 


Grupa kontrolna liczyła 169 osób (średnia wieku 29,40 ::!: 3,56; mediana 29, zakres wieku 
22-41 lat). Były to zdrowe kobiety, hospitalizowane w oddziale Położniczym III Kliniki 
Perinatologii i Chorób Kobiecych UM w Poznaniu, u których co najmniej jedna ciąża 
zakończyła się urodzeniem zdrowego, donoszonego noworodka (średni tydzień zakończenia 
ciąży 38,95 ::!: 1,17; mediana 39, zakres 37-42 tygodnie). W przypadku wieloródek 
upewniano się również co do prawidłowości przebiegu wszystkich poprzednich ciąż. Z 
grupy tej wykluczono kobiety z obciążonym wywiadem w kierunku wystąpienia poronień 
oraz innych powikłań, które mogą być uwarunkowane zmianami zakrzepowymi 
(preeklampsja, zahamowanie wewnątrzmacicznego wzrastania płodu, porody przedwczesne, 
przedwczesne oddzielenie łożyska, obumarcie wewnątrzmaciczne). U badanych kobiet z 
grupy kontrolnej odnotowywano tydzień zakończenia ciąży, sposób zakończenia porodu, 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 30 z 122
		

/p0031.djvu

			parametry urodzeniowe noworodka oraz analizowano przebieg ciąży ze szczególnym 
uwzględnieniem wywiadu położniczego (ilość przebytych ciąż, obecność patologii 
położniczych w obecnej oraz w poprzednich ciążach, jak również w rodzinie). Tydzień 
zakończenia ciąży sprawdzany był dodatkowo poprzez ustalenie daty wystąpienia ostatniej 
miesiączki, regularności cykli miesięcznych, odczuwania pierwszych ruchów płodu oraz 
analizy kolejnych badań ultrasonograficznych wykonywanych podczas ciąży u badanych 
pacjentek. Dane kliniczne pacjentek z obydwu grup - badanej i kontrolnej - zebrano w tabeli 
2. 


Kryteria włączenia I wyłączenia - grupa kontrolna: 
. przebycie co najmniej jednej prawidłowo przebiegającej ciąży ukończonej urodzeniem 
zdrowego donoszonego noworodka, 
. przynależność do rasy białej (kaukaskiej), narodowość polska, 
. wykluczenie obecności poronień, 
. wykluczenie chorób internistycznych. 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 31 z 122
		

/p0032.djvu

			Tabela 2. Dane kliniczne pacjentek z grup badanej (104 osoby) i kontrolnej (169 osób). 


30,15:t (4,07) 29,40 :t (3,56) 0,110 
30 29 
23 / 40 22 / 41 
111,11 :t (11,19) 111,33 :t (10,98) 0,870 
110 110 
90 / 130 90 / 130 
68,27 :t (7,56) 69,64 :t (8,50) 0,177 
70 70 
50 / 80 50 / 80 
167,11 :t (5,34) 166,69 :t (5,77) 0,540 
167,5 167 
153/178 153/180 
58,97:t (7,56) 59,71 :t (9,51) 0,498 
58 58 
42 / 83 43 / 105 
21,1O:t (2,37) 21,48:t (3,21) 0,288 
20,66 20,72 
16,82/28,06 16,36/38,57 
80 
17 
7 
101 pacjentek 
68 pacjentek 
38,95:t (1,17) 
39 
37 /42 
3444,50 :t (410,04) 
3410 
2550 /4610 
9,39 :;!: (1,52) 
10 
1/10 
9,87 :;!: (0,54) 
10 
5/10 
124 
40 
5 
me 159 nie /10 tak 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 32 z 122
		

/p0033.djvu

			3.2. Metodyka 


Materiał badawczy 


Krew żylną do oznaczania polimorfizmów genetycznych pobrano z żyły odłokciowej w 
ilości 3-4 mi badanych pacjentek do probówek S-Monovette (Sarstedt, Niemcy) z żelem 
K2E. Jest to żel zawierający z jako antykoagulant EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy, 
ang. ethylene dżamżne tetraacetżc acżd) w postaci soli dwupotasowej w stężeniu 1,6 mg 
EDTA/ml krwi. Probówki z krwią były przechowywane do czasu izolacji zamrożone w 
temperaturze -20°C. 


W obydwu badanych grupach - kobiet z poronieniami w I trymestrze ciąży i kontrolnej - 
oznaczono częstość występowania polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (SNP ang. 
sżngle nucleotżde polymorphżsm) w pięciu genach kodująch: czynnik V (mutacja Leiden), 
czynnik II (protrombinę) oraz enzym MTHFR (677C>T, 1298A>C, 1793G>A). 
Charakterystykę badanych polimorfizmów przedstawiono w tabeli 3. Nazwy systematyczne 
badanych polimorfizmów podano zgodnie z zaleceniami Human Genome Varżatżon Socżety 
(www.hgvs.org.). 


Tabela 3. Charakterystyka badanych polimorfizmów. 


Iq23 
11 P 11-q 12 
l p36.3 
l p36.3 
l p36.3 


1691G>A 
20210G>A 
667C> T 
1298A>C 
1793G>A 


ExIO-IIA>G 
ExI4-IG>A 
Ex5+79C>T 
Ex8-62A>C 
Ex l 2+29G>A 


A222V 
E429A 
R594Q 


rs6025 
rs 1799963 
rs1801133 
rs1801131 
rs2274976 


Do badań zastosowano łańcuchową reakcj ę polimerazy (PCR - ang. polymerase chażn 
reactżon) oraz metodę polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP - ang. 
restrżctżon .fragment length polymorphżsm). 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 33 z 122
		

/p0034.djvu

			Izolacja DNA 


Głównym celem izolacji jest uzyskanie z maksymalną wydajnością 
wysokocząsteczkowego DNA, przy jednoczesnym oczyszczeniu preparatu z białek i 
inhibitorów enzymów, które mogą utrudniać następne etapy pracy z DNA [Słomski i wsp., 
2004]. Izolację DNA z leukocytów krwi przeprowadzano za pomocą komercyjnego zestawu 
QIAamp DNA Blond Mini Kit (QIAGEN Inc., Niemcy). Jego działanie opiera się na 
zdolności wiązania DNA na złożach krzemionkowych w warunkach wysokich stężeń soli 
chaotropowych. Do probówki odpipetowywano 20 /11 proteinazy K, która wykazuje szeroką 
specyficzność substratową. Do enzymu dodawano 200 /11 krwi pobranej na EDTA oraz 200 
/11 detergentu zawartego w buforze oznaczonym przez firmę symbolem AL w celu 
degradacji błon komórkowych. Całość ogrzewano w temperaturze 56°C przez 10 minut, a 
następnie przenoszono do kolumienki ze złożem krzemionkowym i wirowano l minutę przy 
obrotach 8000 rpm. Kolumnę przenoszono do nowej probówki, a przesącz odrzucano. 
Kolumnę dwukrotnie przemywano 500 /11 buforów oznaczonych przez firmę Al i A2 i 
wirowano odpowiednio przez l minutę 8000 rpm i 3 minuty 14000 rpm, w celu 
oczyszczenia DNA. Na kolumnę nakładano 200 /11 buforu do elucji i po 5 minutach 
wirowano l minutę 8000 rpm. Po tym wirowaniu uzyskiwano już oczyszczone DNA, 
gotowe do użycia w dalszej analizie genetycznej. 


Oznaczanie jakości i ilości preparatów DNA 


Stężenie otrzymanego preparatu DNA obliczano z pomiaru absorpcji przy długości fali 
260 nm określanej jako gęstość optyczna (OD ang. optżcal densżty) - to jest maksymalnej 
absorpcji promieniowania nadfioletowego przez DNA. 
Przyjmuje się, że gdy A260 równa się l to stężenie dwuniciowego DNA (dsDNA) wynosi 
około 50 /1g/ml. Należy jednak pamiętać, że jest to wartość przybliżona, ponieważ wartość 
współczynnika ekstynkcji zależy od składu zasad azotowych w DNA. 


Stężenie DNA= absorbancja przy 260 nm x rozcieńczenie x 50 


Stosunek A260/A280 jest natomiast często stosowną miarą czystości roztworu DNA, a 
ściślej miarą zanieczyszczenia DNA białkami (maksimum absorpcji UV dla białek wynosi 
280 nm). Ogólnie preparat DNA uznaje się za czysty, jeżeli A260/A280 wynosi 1,8-2,0. 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 34 z 122
		

/p0035.djvu

			Jeżeli próbka DNA zanieczyszczona jest RNA to wartość A260/A280 jest bliższa 2,0, 
natomiast jeżeli próbka zanieczyszczona jest białkami to wartość A2601 A280 jest niższa niż 
1,8. Absorpcja mierzona przy długości fali 230 odzwierciedla zanieczyszczenia pochodzące 
od węglowodorów, białek lub fenolu. W przypadku czystych próbek wartość A260/A230 
powinna wynosić 2,2. Absorpcja mierzona przy długości fali 325 nm może być 
wyznacznikiem wytrąceń w roztworze lub zanieczyszczeń samej kuwety. W przypadku 
przekroczenia opisanych zakresów absorbancji, DNA izolowano ponownie. 
Otrzymany DNA sprawdzano również poprzez elektroforezę na 0,8% żelach agarozowych. 
Genomowy DNA widoczny jest w postaci pojedynczego, zwartego prążka o wielkości 
ponad 50 kpz. 


Reakcja łańcuchowej polimerazy- PCR 


Reakcja PCR (ang. polymerase chażn reactżon) służy otrzymywaniu dużej liczby kopii 
określonego fragmentu DNA. Metoda ta opiera się na powielaniu (amplifikacji) żn vżtro 
zdefiniowanego odcinka kwasu dezoksyrybonukleinowego przez polimerazę DNA. 
Warunkiem przeprowadzenia reakcji PCR jest znajomość sekwencji krótkich odcinków 
DNA na końcach 5' i 3' fragmentu DNA, który ma być powielony. Do każdej reakcji PCR 
potrzebne są następuj ące składniki: 
-DNA, który będzie namnożony (matryca), będący zazwyczaj częścią mieszaniny różnych 
cząsteczek DNA, 
- startery o sekwencji komplementarnej do końcowych rejonów odcinka DNA, który będzie 
namnożony, 
- termostabilna polimeraza DNA (wytrzymująca wielokrotne podgrzewanie do temperatury 
powyżej 90°C); enzym łączy się z jednoniciowymi starterami i syntetyzuje nić 
komplementarną do matrycowego DNA, 
- trifosforany nukleozydów - substraty dla polimerazy (dATP, dGTP, dTTP i dCTP), 
- odpowiedni dla polimerazy bufor, zapewniający optymalne warunki dla działania enzymu. 
Namnażanie określonego odcinka DNA następuje podczas powtarzających się cykli syntezy 
DNA. Każdy cykl syntezy składa się z trzech etapów: 
l. denaturacji matrycy (próba jest podgrzewana do temperatury powyżej 90.C, w której 
następuje rozdzielenie dwuniciowych cząsteczek DNA na pojedyncze nici stanowiące 
właściwą matrycę. 
2. przyłączenia starterów (ang. annealżng) do matrycy zachodzi w temperaturze około 40- 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 35 z 122
		

/p0036.djvu

			65°C. Dobiera się ją w zależności od sekwencji nukleotydowej i długości starterów. 
Temperatura ta zapewnia przyłączenie starterów do jednoniciowej matrycy w miejscach 
komplementarnych, jednak nie pozwala na powtórne odtworzenie dwuniciowych cząsteczek 
DNA. 
3. wydłużania starterów odbywa się w temperaturze, w której polimeraza DNA wykazuje 
największą aktywność (dla większości termostabilnych polimeraz DNA jest to około 72°C). 
Polimeraza syntetyzuje nową nić rozpoczynając od startera przyłączonego do jednoniciowej 
matrycy. 
Aby namnożyć określony odcinek DNA, należy przeprowadzić około 15-40 cykli w 
zależności od ilości użytej matrycy. Metoda PCR jest powszechnie wykorzystywana w 
genetyce i biologii molekularnej na różnych etapach badania genów. 


Polimorfizm 1691G>A czynnika V (mutacja Leiden) 


W celu przeprowadzenia reakcji PCR pobierano 25 ng genomowego DNA, 2,5 /11 buforu 
10 x Taq Bufor z (NH4)2S04 (Fermentas, Litwa), 2,5 mM MgCb (Fermentas, Litwa), 0,25 
mM dNTP (GeneCraft Niemcy), 0,45 /1M startera F i R (TibMolBiol,Polska), których 
sekwencja została przedstawiona w tabeli 4, lU Taq polimerazy (Fermentas, Litwa). 
Objętość końcowa reakcji PCR wynosiła 25/11. Warunki reakcji PCR: denaturacja wstępna 
95°C 3 minuty, następnie 35 cykli obejmujących denaturację właściwą 94°C l minuta, 
wiązanie starterów 58°C l minuta, syntezę 72°C 1,5 minuty, po nich następowała synteza 
końcowa 72°C 10 minut. Reakcje przeprowadzano używając term ocykl er PTC200 
Programmable Thermal C ontroll er, (MJ Research Inc., USA).Uzyskany produkt wielkości 
220 par zasad trawiono enzymem restrykcyjnym MnlI (Eurx, Polska). W tym celu pobrano 
19/11 uzyskanego po PCR produktu, 2,5/11 buforu l x Medium Bufor (Eurx, Polska), 2,5/11 
sterylnej wody oraz 1/11 enzymu MnlI. Mieszanina była inkubowana w cieplarce (Memmert, 
Niemcy) przez całą noc w temperaturze 37°C. Po inaktywacji enzymu w 65°C przez 20 
minut dodawano bufor obciążający i nanoszono próbki na 2% żel agarozowy (TiBMolBiol 
Universal Agarose, Polska). Po wybarwieniu żelu w bromku etydyny odczytywano genotypy 
według wielkości fragmentów uzyskanych po trawieniu zgodnie z tab. 5. 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 36 z 122
		

/p0037.djvu

			Tabela 4. Startery użyte do reakcji PCR. 


1298A>C 


F 5' TgC CCA gTg CTT AAC AAg ACC A 3' Bertina i 
R 5' CTT gAA ggA AAT gCC CCA TTA 3' wsp., 1994 
F 5' TCT AgA AAC AgT TgC CTg gC 3' Poort i 
R5' ATAgCACTgggAgCA TTgAAgC3' wsp.,1996 
F 5' TgA Agg AgA Agg TgT CTg Cgg gA 3' Frost i wsp., 
R 5' Agg ACg gTg Cgg TgA gAg Tg 3' 1996 
F 5' CTT CTA CCT gAA gAg CAA gTC3' Hanson i 
R5' CAT gTC CAC AgC ATg gAg 3' wsp.,2001 
F5' CTC TgT gTg TgT gTg CAT gTg TgC g 3' Rady i wsp., 
R5' ggg ACA ggA gTg gCT CCA ACg CAg g3' 2002 


20210G>A 


1793G>A 


Polimorfizm 20210G>A czynnika II (protrombiny) 


Do amplifikacji fragmentu genu protrombiny w reakcji PCR pobierano: 25 ng 
genomowego DNA; 2,5 /11 buforu, 10 x Taq Bufor z (N&)2S04 (Fermentas, Litwa); 2,5 mM 
MgCb (Fermentas, Litwa); 0,25 mM dNTP (GeneCraft, Niemcy); 0,45 /1M startera F i R 
(TibMolBiol, Polska) oraz lU Taq polimerazy (Fermentas, Litwa). Substraty uzupełniano 
sterylną wodą do końcowej objętości 25/11. Profil termiczny wraz z czasami trwania 
poszczególnych etapów reakcji PCR przedstawiono na rys. 6. 


Temperatura 


. 
1X 30X 1X 

. -. -. - 
 - 
- - , 
I 95°C 95°C 
3min 1min , 
f \ \ 
noc noc 
I \ / 1.3 Omin 10 \ 
I mm 
58°C \ 
I 1min 
\ 
I -4°C 
00 


Cżas 


Ryc. 7. Profil termiczny i czas reakcji PCR dla polimorfizmu 20210G>A protrombiny. 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 37 z 122
		

/p0038.djvu

			Reakcje przeprowadzano używając termocykler PTCIOO Programmable Thermal Controller, 
(MJ Research Inc., USA).Uzyskany produkt wielkości 345 par zasad trawiono enzymem 
restrykcyjnym HżndIII (Fermentas, Litwa). W tym celu pobrano 19/11 uzyskanego po PCR 
produktu, 2,5/11 buforu l x Bufor R (Fermentas, Litwa), 2,5/11 sterylnej wody oraz 1/11 
enzymu HżndIII. Mieszaninę inkubowano w cieplarce (Memmert, Niemcy) przez całą noc w 
temperaturze 37°C. Po czym inaktywowano enzym w 65°C przez 20 minut i dodawano 
bufor obciążający. Elektroforezę prowadzono w 2,5% żelu agarozowm (TiBMolBiol, 
Polska) w buforze l x TBE przy napięciu 210V przez 3 godziny. Po wybarwieniu żelu w 
bromku etydyny odczytywano Genotypy odczytywano w sposób przedstawiony w tab. 5. 


Tabela 5. Wielkości fragmentów po reakcji hydrolizy oraz stosowane enzymy restrykcyjne 
przy oznaczeniu polimorfizmów genetycznych badanych genów. 


MnlI GG 116, 67, 37 pz 
(Eurx ) CC TC(N) t (7/6) 220 pz GA 153, 116,67,37 pz 
AA 153,67 z 
HżndIII GG 345 pz 
(F ermentas) AtAGCTT 345 pz GA 345, 322,23 pz 
AA 322, 23 pz 
Hżnjl CC 198 pz 
(Eurx ) GtANTC 198 pz CT 198, 175,23 pz 
TT 175,23 pz 
MboII AA 176, 30, 28, 22 pz 
(F ermentas) (JJ\J\(J(N) t (8/7) 256 pz AC 204, 176, 30, 28, 22 pz 
CC 204, 30, 22 z 
MbżI (BsrBI) GG 233, 77 pz 
(F ermentas) CCGtCTC 3 10 pz GA 310, 233, 77 pz 
AA 310 pz 
Polimorfizm 677C> T genu MTHFR 


Przygotowując reakcję PCR dla polimorfizmu 677C>T genu MTHFR pobierano 25 ng 
genomowego DNA, 2,5 /11 buforu 10 x Taq Bufor z (N&)2S04 (Fermentas, Litwa), 2,5 mM 
MgCb (Fermentas, Litwa), 0,25 mM dNTP (GeneCraft, Niemcy), 0,45 /1M każdego ze 
starterów dla tej reakcji (TibMolBiol, Polska) (tabela 8), l U Taq polimerazy (Fermentas, 
Litwa). Suma składników reakcji PCR wynosiła 25/11. Warunki reakcji PCR, którą 
przeprowadzano używaj ąc termocykler PTC l 00 Programmable Thermal C ontroll er, (MJ 
Research Inc., USA) były następujące: denaturacja wstępna 95°C 3 minuty, po czym 
następowało 35 cykli (denaturacja 94°C l minuta, wiązanie starterów 60°C l minuta, 
synteza 72°C 1,5 minuty). Synteza końcowa trwała 10 minut w temperaturze 72°C. 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 38 z 122
		

/p0039.djvu

			Produkt o wielkości 198 par zasad poddawano trawieniu enzymem restrykcyjnym Hżnjl 
(Eurx, Polska). Do hydrolizy restrykcyjnej pobrano 19/11 uzyskanego we wcześniejszej 
reakcji PCR produktu, 2,5/11 buforu l x Medium Bufor (Eurx, Polska), 2,5/11 sterylnej wody 
oraz 1/11 enzymu Hżnjl. Po całonocnej inkubacji mieszaniny w temperaturze 37°C w 
cieplarce (Memmert, Niemcy) inaktywowano enzym 20 minut w 65°C. Po dodaniu buforu 
obciążającego nakładano próbki na 2,5% żel agarozowy (TiBMolBiol, Polska). 
Elektroforezę prowadzono w buforze l x TBE przy napięciu 210V przez l godzinę i 40 
minut. Żel barwiono bromkiem etydyny i odczytywano genotypy zgodnie z tab.5. 


Polimorfizm 1298A>C genu MTHFR 


Do identyfikacji polimorfizmu 1298A>C genu MTHFR przeprowadzono amplifikację 
używając termocykler PTC200 Programmable Thermal Controller, (MJ Research Inc., USA) 
Przygotowując reakcję PCR pobierano 25 ng genom owego DNA, 2,5 /11 buforu 10 x Taq 
Bufor z (NH4)2S04 (Fermentas, Litwa), 2,5 mM MgCb (Fermentas, Litwa), 0,25 mM dNTP 
(GeneCraft, Niemcy), 0,45 /1M starterów F i R (TibMolBiol, Polska) (tabela 4), l U Taq 
polimerazy (Fermentas, Litwa). Składniki reakcji PCR mieszano ze sterylną wodą tak aby 
objętość końcowa reakcji wynosiła 25/11. Reakcję PCR przeprowadzano w następujących 
warunkach: denaturacja wstępna 95°C 3 minuty, następnie 35 cykli (denaturacja 94°C l 
minuta, wiązanie starterów 58°C l minuta, synteza 72°C 1,5 minuty) oraz synteza końcowa 
10 minut w temperaturze 72°C. 
Otrzymany produkt PCR wielkości 256 par zasad hydrolizowano enzymem restrykcyjnym 
MboII. Do reakcji uzywano 19/11 uzyskanego produktu PCR; 2,5/11 buforu B (lx) 
(Fermentas, Litwa), 2,5/11 sterylnej wody oraz 1/11 enzymu. Po całonocnej inkubacji 
mieszaniny w temperaturze 37°C w cieplarce (Memmert, Niemcy) inaktywowano enzym 20 
minut w 65°C. Po dodaniu buforu obciążającego nakładano próbki na 2,5% żel agarozowy 
(Omega micropor, Prona). Elektroforezę prowadzono w buforze l x TBE przy napięciu 
210V przez 2 godziny. Żel barwiono bromkiem etydyny przez 20 minut i odczytywano oraz 
dokumentowano (UVI-KS4000i/ImagePC, Syngen Biotech, USA) genotypy zgodnie z tab.5. 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 39 z 122
		

/p0040.djvu

			Polimorfizm 1793G>A genu MTHFR 


W celu przeprowadzenia amplifikacji fragmentu genu MTHFR zawierającego miejsce 
polimorfizmu 1793G>A pobierano 25 ng genom owego DNA; 2,5 /11 buforu 10 x Taq Bufor 
z (NH4)2S04 (Fermentas, Litwa), 2,5 mM MgCb (Fermentas, Litwa), 0,25 mM dNTP 
(GeneCraft, Niemcy), 0,45 /1M każdego ze starterów dla tej reakcji (TibMolBiol, Polska) 
(tabela 8), lU Taq polimerazy (Fermentas, Litwa). Składniki reakcji PCR wraz ze sterylną 
wodą miały objętość 25/11. Warunki reakcji PCR, którą przeprowadzano używając 
termocykler PTC200 Programmable Thermal Controller, (MJ Research Inc., USA) były 
następujące: denaturacja wstępna 95°C 3 minuty, po czym następowało 35 cykli 
(denaturacja 94°C l minuta, wiązanie starterów 60°C l minuta, synteza 72°C 1,5 minuty). 
Synteza końcowa trwała 10 minut w temperaturze 72°C. 
Produkt o wielkości 310 par zasad poddawano trawieniu enzymem restrykcyjnym. Do 
hydrolizy restrykcyjnej pobrano 19/11 uzyskanego we wcześniejszej reakcji PCR produktu, 
2,5/11 buforu l x Medium Bufor (Eurx, Polska), 2,5/11 sterylnej wody oraz 1/11 enzymu MbżI 
(BsrBI). Inkubowano mieszaninę w temperaturze 37°C w cieplarce (Memmert, Niemcy), a 
następnie inaktywowano enzym 20 minut w 65°C. Po dodaniu buforu obciążającego 
nakładano próbki na 2,5% żel agarozowy (TiBMolBiol, Polska). Elektroforezę prowadzono 
w buforze l x TBE przy napięciu 210V przez l godzinę i 40 minut. Żel barwiono bromkiem 
etydyny i odczytywano genotypy zgodnie z tab.5. 


3.1. Metody statystyczne zastosowane w pracy 


Analizę statystyczną wyników częstości występowania genotypów i polimorficznych 
alleli badanych genów uzyskanych w pracy zastosowano program statystyczny SPSS 14.0 
PL dla Windows. W celu przeprowadzenia analizy statystycznej utworzono w Edytorze 
Danych SPSS 14.0 PL bazę danych, w której zamieszczono dane kliniczne badanych 
pacjentek i częstość występowania genotypów analizowanych polimorfizmów. 
Analizując dane kliniczne pacjentek obliczano wartości średnie arytmetyczne, czyli sumę 
wszystkich wartości podzielone przez ich liczbę oraz odchylenie standardowe (::!:SD ang. 
standard devżatżon), które jest miarą rozproszenia wartości indywidualnych wokół średniej 
próby. Podawano także zakres wartości obserwowanych obliczając wartości minimalne i 
maksymalne. Normalność rozkładu oceniano przy pomocy nieparametrycznego testu 
Kołmogorowa-Smirnowa z poprawką Lilleforsa. Wyniki przedstawiono jako średnie 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 40 z 122
		

/p0041.djvu

			arytmetyczne lub mediany. Analizę statystyczną prowadzono przy pomocy analizy wariancji 
testu Kruskala-Wallisa dla danych podlegających rozkładowi normalnemu. Szczegółową 
analizę danych wykonywano przy pomocy testu post-hoc NIR (najmniej szych istotnych 
różnic - ang. least sżgnżficant dif.ferences [LSD]) przy założeniu prawdopodobieństwa 
istotności róznic p<0,05 [Górniak i wsp., 2003]. Wartości średnie danych klinicznych 
pomiędzy poszczególnymi grupami porównywano za pomocą testu U- Manna-Whitney'a 
oraz testu ANOV A. 


Wartości obserwowane w badaniu porównywano z wartościami oczekiwanymi (W.O), 
które obliczano na podstawie częstości występowania alleli danego genu. Proporcje 
genotypów dla locus o dwu allelach A i a, których frekwencje wynoszą odpowiednio p i q 
zgodnie z prawem Hardy' ego- Weinberga wyniosą: 
2 2 
P +2pq+q =1 


p = 2NAA+NAa I 2(NAA+NAa+N aa ) 
q = 2N aa +N Aa I 2(NAA+NAa+Naa) 


Otrzymane rezultaty podawano z 95% przedziałem ufności (PU) zarówno dla 
otrzymanych alleli, jak i genotypów. 95% przedział ufności obliczano dzięki użyciu 
programu Clinical Triais Design Program wersja 1.0. Przy wszystkich otrzymanych 
częstościach występowania genotypów i alleli obliczano współczynnik ryzyka (W.R. - 
współczynnik ryzyka, iloraz szans, ang. odds ratżo). Wartość p < 0,05 przyjęto za 
statystycznie istotną. Rozkład genotypów w badanych grupach porównywano testem chi- 
kwadrat z poprawką Fishera. Po oznaczeniu wszystkich badanych polimorfizmów 
genetycznych wyznaczono ich wzajemne korelacje, które porównywano za pomocą 
współczynnika korelacji Pearsona oraz testem chi-kwadrat. 
W celu oceny częstości występowania haplotypów polimorfizmów genu MTHFR 
stosowano program PHASE służący do szacowama częstości haplotypów [http:// 
depts.washington.edu/ventures/UW _ Technology/Express _ Licences/fastPHASKphp, USA]. 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 41 z 122
		

/p0042.djvu

			4. WYNIKI 


4.1. Charakterystyka danych kobiet z badanych grup 


W pracy analizowano dane uzyskane od 273 kobiet rasy kaukaskiej i narodowości 
polskiej. Zostały one następnie zakwalifikowane do dwóch grup: l) 104 kobiet z dwoma i 
więcej poronieniami w pierwszym trymestrze ciąży (grupa badana), 2) 169 zdrowe kobiety, 
u których nie wystąpiły poronienia (grupa kontrolna). Dokładną charakterystykę obu 
badanych grup przedstawiono w tabeli 6, w podrozdziale 3.1. 
Pacjentki z obu badanych grup były w porównywalnym wieku (średnia w grupie badanej 
30,15 ::!: 4,07 lat, a w grupie kontrolnej 29,40 ::!: 3,56 lat, p=0,110). Nie zaobserwowano 
również różnic w wartościach ciśnienia tętniczego pomiędzy analizowanymi grupami. 
Średnie ciśnienie skurczowe wynosiło 111,11 ::!: 11,19 mmHg w grupie badanej oraz 111,33 
::!: 10,98 mmHg w grupie kontrolnej (p=0,870), a rozkurczowe odpowiednio 68,27 ::!: 7,56 VS. 
69,64 ::!: 8,50 mmHg (p=0,177). Porównywalne były także średnie wartości wzrostu (167,11 
::!: 5,34 VS. 166,69 ::!: 5,77 cm, p=0,540), masy ciała (58,97 ::!: 7,56 VS. 59,71 ::!: 9,51 kg, 
p=0,498) oraz wskaźnika BMI (21,10 ::!: 2,37 VS. 21,48 ::!: 3,21 kg/m 2 , p=0,288) pomiędzy 
tymi grupami. 
Cechami różniącymi obydwie grupy była obecność poronień, których występowania nie 
stwierdzono u żadnej pacjentki z grupy kontrolnej, natomiast w drugiej z analizowanych 
grup wystąpiły 2 poronienia u 80 kobiet, 3 u 17 kobiet oraz 4 u 7 pacjentek. Różniącą obie 
badane grupy cechą okazało się palenie papierosów (w grupie kontrolnej 10 kobiet 
przyznało się do palenia nawet w ciąży, natomiast żadna z kobiet po dwóch i więcej 
poronieniach nie przyznała się do palenia papierosów). 
U kobiet z grupy kontrolnej odnotowano również średnie wartości dotyczące przebiegu 
ostatniej ciąży. Wynosiły one: tydzień zakończenia ciąży 38,95::!: 1,17, masa noworodka 
3444,50 ::!: 410,04 g, wartości skali Apgar w l minucie 9,39 ::!: 1,52 oraz w 5 minucie 9,87 ::!: 
0,54. U 124 pacjentek nastąpił poród samoistny siłami natury, 40 pacjentek urodziło dziecko 
poprzez cięcie cesarskie (naj częstszym wskazaniem do cięcia cesarskiego było: brak postępu 
porodu, położenie miednicowe płodu, wskazania okulistyczne u matki), u 5 kobiet natomiast 
poród ukończono operacyjnie poprzez zastosowanie kleszczy oraz wyciągacza próżniowego 
(wskazania: objawy zagrożenia życia płodu, brak postępu w II okresie porodu). 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 42 z 122
		

/p0043.djvu

			4.2. Częstość występowania polimorfizmów genów warunkujących 
wrodzoną trombofilię w grupie kobiet z dwoma i więcej poronieniami oraz 
w grupie kontrolnej 


W tej części pracy analizowano frekwencję występowania genotypów i alleli badanych 
wariantów genetycznych (czynnik V, czynnik II, MTHFR) w całej grupie 104 kobiet z 
dwoma lub więcej poronieniami oraz w grupie kontrolnej 169 zdrowych kobiet z 
nieobciążonym wywiadem położniczym. Wyznaczone metodą PCR/RPLP genotypy 
analizowanych polimorfizmów przedstawiają fotografie 1,2,3,4,5, zamieszczone poniżej. 


Mutacja Leidell 


W podgrupie kobiet z dwoma lub więcej poronieniami (104 osoby) występowanie 
genotypów GG oraz GA mutacji 1691G>A było podobne zarówno w grupie badanej jak i 
kontrolnej (dla genotypu GG 93,27: 93,49%, WR=0,96, p=0,56 dla genotypu GA 6,73: 6,51, 
WR=I,04, p=0,56). W zakresie tego polimorfizmu nie stwierdzono występowania 
zmutowanych homozygot AA w obydwu badanych grupach (tab. 6). Wartości obserwowane 
i oczekiwane genotypów polimorfizmu 1691G>A spełniały założenia prawa Hardy'ego- 
Weinberga. Również częstość pojawiania się alleli G oraz A dla tej mutacji była 
porównywalna dla obydwu grup (dla allela G 96,63: 96,75%, WR=0,96, p=0,56; dla allelaA 
3,37: 3,25, WR=I,04, p=0,56). 


Tabela 6. Częstość występowania genotypów i alleli polimorfizmu 1691G>A czynnika V w 
grupie badanej z poronieniami oraz w grupie kontrolnej. 


97 (93,27) 158 (93,49) 
7 (6,73) 11 (6,51) 
O (0,00) O (0,00) 
104 (100,00) 169 (100,00) 
201 (96,63) 327 (96,75) 0,96 0,33-2,99 0,56 
7 (3,37) 11 (3,25) 1,04 0,33-2,98 0,56 
208 (100,00) 338 (100,00) 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 43 z 122
		

/p0044.djvu

			Fot. 1. Analiza genotypów polimorfizmu 1691G>A czynnika V (mutacja Leiden) po 
hydrolizie enzymem restrykcyjnym MnlI. Tor l marker wielkości (50 pz), tory 2, 3, 4, 6, 8 
homozygoty GG, tory 5,7 heterozygoty GA. 


W wyniku hydrolizy enzymem restrykcyjnym MnlI (Fermentas, Litwa) fragmentu genu 
czynnika V o wielkości 220 par zasad, zawierającego miejsce występowania mutacji Leiden, 
można było uzyskać od 2 do 4 fragmentów o różnej wielkości. W przypadku homozygot 
niezmutowanych GG (typ dziki) uzyskiwano trzy fragmenty 116, 67 i 37 par zasad. Genotyp 
zmutowany AA, który nie został odnaleziony wśród badanych pacjentek, powoduje brak 
jednego miejsca hydrolizy dla enzymu MnlI i powstają tylko dwa prążki o wielkości 153 i 
67 par zasad. Heterozygotyczny genotyp GA powoduje wystąpienie wszystkich czterech 
możliwych miejsc cięcia dla enzymu restrykcyjnego w tym fragmencie genu i uzyskuje się 
prążki wielkości 153, 116,67 i 37 par zasad (fot. l). 


Polimorfizm genu protrombiny 


Podobnie jak w przypadku mutacji Leiden, również w zakresie polimorfizmu 20210G>A 
czynnika II nie obserwowano występowania zmutowanych homozygot AA w obydwu 
badanych grupach. W podgrupie kobiet z poronieniami stwierdzono natomiast niewielką 
przewagę występowania heterozygotycznego genotypu GA (2,88 VS. 1,18 w grupie 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 44 z 122
		

/p0045.djvu

			kontrolnej) przy stosunkowo wysokim współczynniku ryzyka WR=2,48 mimo braku różnicy 
statystycznie istotnej (p=0,284) (tab. 7). Obserwowano również przewagę występowania 
zmutowanego allela A (1,44 VS. 0,59% w grupie kontrolnej WR=2,46) bez istotności 
statystycznej (p=0,28). Obserwowana częstość występowania genotypów polimorfizmu 
20210G>A genu protrombiny nie różniła się w sposób istotny statystycznie od częstości 
oczekiwanych genotypów. 


Tabela 7. Częstość występowania poszczególnych genotypów i alleli polimorfizmu 20210 
G>A czynnika II w grupie badanej z poronieniami oraz w grupie kontrolnej. 


101 (97,12) 167 (98,82) 
3 (2,88) 2 (1,18) 
O (0,00) O (0,00) 
104 (100,00) 169 (100,00) 
205 (98,56) 336 (99,41) 0,40 0,33-3,59 0,28 
3 (1,44) 2 (0,59) 2,46 0,28-29,62 0,28 
208 (100,00) 338 (100,00) 


Po enzymatycznej hydrolizie produktu PCR fragmentu genu protrombiny o wielkości 345 
par zasad oskrzydlającego miejsce mutacji 20210G>A możliwe było uzyskanie od jednego 
do trzech mniejszych fragmentów DNA. W przypadku genotypu typu dzikiego (homozygota 
GG) uzyskiwano jeden prążek o wielkości równej z produktem PCR. Oznacza to, że w 
sekwencji dwóch alleli analizowanego fragmentu nie występowało miejsce hydrolizy 
rozpoznawane przez enzym restrykcyjny HżndIII. Cięcie przez enzym następowało w 
przypadku tranzycji guaniny na adeninę w pozycji 20210. W genotypie heterozygotycznym 
GA uzyskiwano trzy fragmenty o wielkości 345, 322 i 23 par zasad, a w przypadku 
nosicielstwa przez badaną osobę dwóch zmutowanych alleli (genotyp M, który nie 
występował w badanej grupie kobiet) dwa fragmenty 322 i 23 par zasad (fot. 2). 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 45 z 122
		

/p0046.djvu

			Fot. 2. Analiza genotypów polimorfizmu 20210G>A czynnika II po hydrolizie enzymem 
restrykcyjnym HżndIII. Tor l marker wielkości (50 pz), tory 3, 4, 6, homozygoty GG, tory 2, 
5, heterozygoty GA. 


Polimorfizm genu MTHFR 


W stosunku do polimorfizmu genu MTHFR 677C> T me zaobserwowano różnic 
statystycznie istotnych w częstości występowania zarówno zmutowanych genotypów, jak i 
alleli. Frekwencja genotypu dzikiego CC była niższa w grupie z poronieniami w porównaniu 
do grupy kontrolnej (42,31 VS. 52,66%, p=0,06). Natomiast genotyp heterozygotyczny CT 
pojawił się częściej w grupie kobiet z poronieniami (47,11 VS. 39,64%, p=0,14). 
Odnotowano także niewielkiego stopnia przewagę występowania genotypu TT (10,58 VS. 
7,69, p=0,27), jak również zmutowanego allela T (34,13 VS. 27,51 w grupie kontrolnej, 
p=0,06) dla tego polimorfizmu (tab. 8). 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 46 z 122
		

/p0047.djvu

			Tabela 8. Częstość występowania poszczególnych genotypów i alleli polimorfizmu 677C> T 
MTHFR w grupie badanej z poronieniami oraz w grupie kontrolnej. 


44 (42,31) 89 (52,66) 
49(47,11) 67 (39,64) 
11 CI 0,58) 13 (7,69) 
104 CI 00,00) 169 (100,00) 
137 (65,87) 245 (72,49) 0,73 0,49-1,08 0,06 
71 (34,13) 93 (27,51) 1,36 0,92-2,01 0,06 
208 CI 00,00) 338 (100,00) 


Fot. 3. Analiza genotypów polimorfizmu 677C> T MTHFR po hydrolizie enzymem 
restrykcyjnym Hżnjl. Tor l marker wielkości (50 pz), tory 4, 5, homozygoty CC, tory 3, 7 
heterozygoty CT, tory 2, 6, homozygoty zmutowane TT. 


Fotografia 3 przedstawia produkt reakcji PCR dla polimorfizmu 677C>T genu MTHFR po 
enzymatycznej hydrolizie enzymem Hżnjl. Fragment wielkości 198 par zasad po działaniu 
endonukleazy został podzielony na jeden do trzech mniejszych odcinków. W genotypie typu 
dzikiego (homozygota CC) nie występowało miej sce hydrolizy rozpoznawane przez enzym 
restrykcyjny i uzyskiwano jeden prążek. W genotypie heterozygotycznym CT uzyskiwano 
trzy fragmenty o wielkości 198, 175 i 23 par zasad, a w homozygotycznym zmutowanym 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 47 z 122
		

/p0048.djvu

			TT, dwa fragmenty 175 i 23 par zasad. 


Częstość genotypów homozygotycznych AA i heterozygotycznych AC dla polimorfizmu 
1298A>C w grupie 104 kobiet z poronieniami wynosiły odpowiednio: (38,46 i 49,04 VS. 
46,15 i 43,79%). W przypadku genotypu zmutowanego CC zaobserwowano niewielką 
przewagę jego występowania w grupie z poronieniami (12,50 VS. 10,06, p=0,33). Również 
niewielka przewaga w tej grupie kobiet wystąpiła w częstotliwości pojawiania SIę 
zmutowanego allela C (37,02 VS. 31,95 w grupie kontrolnej, p=O,13) (tab. 9). 


Tabela 9. Częstość występowania poszczególnych genotypów i alleli polimorfizmu 
1298A>C MTHFR w grupie badanej z poronieniami oraz w grupie kontrolnej. 


40 (38,46) 78 (46,15) 
51 (49,04) 74 (43,79) 
13 (12,50) 17 (10,06) 
104 (100,00) 169 (100,00) 
131 (62,98) 230 (68,05) 0,79 0,54-1,17 0,13 
77 (37,02) 108 (31,95) 1,25 0,85-1,83 0,13 
208 (100,00) 338 (100,00) 


Na fotografii 4 została przedstawiona przykładowa analiza polimorfizmu 1298A>C genu 
reduktazy metylenoterahydrofolianowej metodą PCR/RPLP. Produkt reakcji PCR o 
wielkości 256 par zasad poddawano następnie hydrolizie enzymem restrykcyjnym MboI i 
uzyskiwano od trzech do pięciu fragmentów o następujących wielkościach: homozygota AA 
(typ dziki) 176, 30, 28 i 22 pz; heterozygota AC 204, 176, 30, 28, 22 pz oraz homozygota 
zmutowana CC 204,30,22 par zasad. 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 48 z 122
		

/p0049.djvu

			Fot. 4. Analiza genotypów polimorfizmu 1298A>C MTHFR po hydrolizie enzymem 
restrykcyjnym MboII. Tor l marker wielkości (50 pz), tory l, 2, 3, 4, homozygoty AA, tory 
6, 7 heterozygoty AC, tor 5 homozygota zmutowana Cc. 


W genieMTHFR naj ciekawsze obserwacje dotyczyły polimorfizmu 1793G>A, w którym 
wystąpiła znacząca przewaga heterozygot GA (15,38 VS. 4,14 w grupie kontrolnej, różnica 
istotna statystycznie p=0,0014) (tab. 10) oraz znacząca przewaga zmutowanych alleli A 
(7,69 VS. 2,07 w grupie kontrolnej, różnica statystycznie istotna p=0,0018). 
Porównanie wartości obserwowanych z oczekiwanymi wykazało, że rozkład genotypów w 
badanych polimorfizmach genu MTHFR spełnia założenia równowagi Hardy' ego- 
Weinberga. 
Tabela 10. Częstość występowania poszczególnych genotypów i alleli polimorfizmu 
1793G> A MTHFR w grupie badanej z poronieniami oraz w grupie kontrolnej. 


88 (84,62) 162 (95,86) 
16 (15,38) 7 (4,14) 
O (0,00) O (0,00) 
104 (100,00) 169 (100,00) 
192 (92,31) 331 (97,93) 0,25 0,09-0,67 0,00 
16 (7,69) 7 (2,07) 3,94 1,49-11,50 0,00 
208 (100,00) 338 (100,00) 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 49 z 122
		

/p0050.djvu

			W celu zbadania polimorfizmu 1793G>A genu MTHFR przeprowadzono amplifikację 
genomowego DNA ze starterami przedstawionymi w tabeli 4, w celu otrzymania produktu 
PCR o wielkości 310 pz. Po hydrolizie restrykcyjnej enzymem MbżI (BsrBI) odczytywano 
genotypy z żeli agarozowych, których przykład przedstawia fot. 5. Obraz dwóch prążków o 
wielkościach 233 i 77 pz odczytywano jako obecność homozygoty niezmutowanej GG. Trzy 
fragmenty, oznaczające, że w sekwencji analizowanego fragmentu genu MTHFR 
występowało jedno miejsce restrykcyjne dla enzymu MbżI i dotyczyło ono jednego allela, 
odczytywano jako heterozygota GA. Nie zaobserwowano wśród badanych kobiet 
poj edynczego prążka oznaczaj ącego obecność homozygoty zmutowanej AA. 


Fot. 5. Analiza genotypów polimorfizmu 1793G>A MTHFR po hydrolizie enzymem 
restrykcyjnym MbżI (BsrBI). Tor l marker wielkości (50 pz), tory 2, 3, 4, 6, 7 homozygoty 
GG, tor 5, heterozygota GA. 


4.3. Częstość występowania polimorfizmów badanych genów w grupach 
kobiet z dwoma oraz trzema i więcej poronieniami 


W następnym etapie pracy podzielono grupę 104 kobiet z poronieniami w I trymestrze 
ciąży na dwie podgrupy ze względu na ilość występujących u nich poronień. W pierwszej 
podgrupie zamieszczono 80 pacjentek, u których wystąpiły dwa poronienia natomiast w 
drugiej 24 kobiet z trzema lub więcej poronieniami w wywiadzie. 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 50 z 122
		

/p0051.djvu

			Mutacja Leiden 


Częstość występowania genotypów oraz alleli była podobna pomiędzy podgrupą kobiet z 
dwoma poronieniami oraz grupą kontrolną (dla genotypu heterozygotycznego GA: 7,50 VS. 
6,51%, WR=I,16; 95%P.U 0,34-3,59; p=0,48; dla allela A: 3,75 VS. 3,25%; WR=I,16; 
95%P.U 0,35-3,49; p=0,48). Brak różnic istotnych statystycznie stwierdzono także w 
porównaniu częstości występowania genotypów i alleli w podgrupie trzech i więcej poronień 
oraz grupie kontrolnej (4,17 VS. 6,51%, WR=0,62, p=0,54 dla genotypu GA oraz p=0,54 dla 
allela A). Podobnie, brak różnic statystycznie istotnych odnotowano porównując podgrupy z 
poronieniami pomiędzy sobą (dla genotypu GA: p=0,49, dla allela A: p=0,49). W obydwu 
podgrupach badanych nie zaobserwowano występowania zmutowanych homozygot AA. 
Wartości genotypów obserwowanych były zgodne z wartościami genotypów oczekiwanych 
obliczanymi na podstawie prawa Hardy'ego - Weinberga. 


Tabela 11. Częstość występowania poszczególnych genotypów i alleli polimorfizmu 
1691 G> A czynnika V w grupie badanej z dwoma, trzema i więcej oraz grupie kontrolnej. 


74 (92,50) 
6 (7,50) 
O (0,00) 
80 (100,00) 


23 (95,83) 
l (4,17) 
O (0,00) 
24 (100,00) 


158 (93,49) 
11 (6,51) 
O (0,00) 
169 (100,00) 


154 (96,25) 
6 (3,75) 
160 (100,00) 


47 (97,92) 
l (2,08) 
48 (100,00) 


327 (96,75) 
11 (3,25) 
338 (100,00) 


Polimorfizm genu protrombiny 


W podgrupie kobiet z dwoma poronieniami częstość występowania heterozygotycznego 
genotypu GA była porównywalna z wartością uzyskaną dla grupy kontrolnej (1,25 VS. 
1,18%, p=0,69), natomiast w podgrupie z trzema i więcej poronieniami zaobserwowano 
zdecydowaną przewagę występowania tego genotypu (8,33 VS. 1,18%). Różnica ta okazała 
się jednak statystycznie nieistotna (p=0,07). Podobnie przy porównywaniu częstości 
występowania zmutowanego allela A w podgrupie z dwoma poronieniami częstość jego 
występowania była podobna (0,62 VS. 0,59%, p=0,68). Również w podgrupie kobiet z trzema 
i więcej poronieniami obserwowano różnicę statystycznie nieistotną w częstości pojawiania 
się allela A pomiędzy tą podgrupą a grupą kontrolną (p=0,07) mimo znaczącej przewagi jego 
pojawiania się w grupie z poronieniami (4,17 VS. 0,59% w grupie kontrolnej). W całej 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 51 z 122
		

/p0052.djvu

			badanej populacji kobiet nie stwierdzono występowania homozygot zmutowanych M dla 
omawianego polimorfizmu (tab. 12). Zaobserwowano także brak istotnych statystycznie 
różnic pomiędzy wartościami oczekiwanymi, obliczonymi zgodnie z prawem Hardy'ego - 
Weinberga, a obserwowanymi w badanych grupach. 


Tabela 12. Częstość występowania poszczególnych genotypów i alleli polimorfizmu 
20210G>A czynnika II w grupie badanej z dwoma, trzema i więcej oraz grupie kontrolnej. 


79 (98,75) 
l (1,25) 
O (0,00) 
80 (100,00) 


22 (91,67) 
2 (8,33) 
O (0,00) 
24 (100,00) 


167 (98,82) 
2 (1,18) 
O (0,00) 
169 (100,00) 


159 (99,38) 
l (0,62) 
160 (100,00) 


46 (95,83) 
2 (4,17) 
48 (100,00) 


336 (99,41) 
2 (0,59) 
338 (100,00) 


Polimorfizm genu MTHFR 


W zakresie polimorfizmu 677C> T stwierdzono znacznie wyższą częstość występowania 
genotypu zmutowanego TT w podgrupie z trzema i więcej poronieniami (20,83 VS. 7,69% w 
grupie kontrolnej (WR=3,15, 95%P.U 0,78-10,75, p=0,05) oraz allela T 39,85 VS. 27,51%, 
(p=0,06). Dla obydwu porównań frekwencji genotypu TT oraz allela T uzyskano graniczną 
wartość p. Natomiast rozkład wartości uzyskany dla podgrupy z dwoma poronieniami nie 
różnił się tak znacząco od obserwowanych w grupie kontrolnej (dla genotypu TTp=0,59, dla 
allela T p=O, 15), chociaż występowanie genotypu heterozygotycznego CT było wyższe niż 
w grupie kontrolnej (50,00 VS. 39,64%, p=0,08). Najczęściej allel dziki C występował w 
grupie kontrolnej (72,49%), następnie w podgrupach z dwoma poronieniami (67,50%) oraz z 
trzema i więcej (60,42%) (również statystycznie nieistotne) (tab. 13). 
Badaj ąc polimorfizm 1298A>C zaobserwowano statystycznie nieistotny wzrost częstości 
występowania zmutowanego genotypu CC w obu podgrupach z poronieniami (dla dwóch 
poronień 12,50 VS. 10,06% w grupie kontrolnej, p=0,35), dla trzech i czterech poronień 
(12,50 VS. 10,06%, p=0,47). Genotyp heterozygotyczny najczęściej wystąpił w podgrupie z 
dwoma poronieniami (50,00% oraz 45,83% VS. 43,79% w grupie kontrolnej). Również 
uwidoczniła się, statystycznie nieistotna, przewaga w występowaniu zmutowanego allela C: 
nieznaczne w podgrupie z trzema i więcej (35,42 VS. 31,95%, p=O,13) a wyraźniej w 
podgrupie z dwoma poronieniami (37,50 VS. 31,95% w grupie kontrolnej, p=0,37) (tab. 14). 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 52 z 122
		

/p0053.djvu

			Tabela 13. Częstość występowania poszczególnych genotypów i alleli polimorfizmu 
677C>T MTHFR w grupie badanej z dwoma, trzema i więcej oraz grupie kontrolnej. 


34 (42,50) 10 (41,67) 89 (52,66) 
40 (50,00) 9 (37,50) 67 (39,64) 
6 (7,50) 5 (20,83) 13 (7,69) 
80 (100,00) 24 (100,00) 169 (100,00) 
108 (67,50) 29 (60,42) 245 (72,49) 
52 (32,50) 19 (39,58) 93 (27,51) 
160 (100,00) 48 (100,00) 338 (100,00) 


Tabela 14. Częstość występowania poszczególnych genotypów i alleli polimorfizmu 
1298A>C MTHFR w grupie badanej z dwoma, trzema i więcej oraz grupie kontrolnej. 


30 (37,50) 10 (41,67) 78 (46,15) 
40 (50,00) 11 (45,83) 74 (43,79) 
10 (12,50) 3 (12,50) 17 (10,06) 
80 (100,00) 24 (100,00) 169 (100,00) 
100 (62,50) 31 (64,58) 230 (68,05) 
60 (37,50) 17 (35,42) 108 (31,95) 
160 (100,00) 48 (100,00) 338 (100,00) 


W trzecim z badanych polimorfizmów reduktazy metylenotetrahydrofolianowej 1793G>A, 
najczęściej zmutowany allel A wystąpił w podgrupie z dwoma i więcej poronieniami. (8,13 
VS. 2,07% w grupie kontrolnej, p=0,002, WR=4,18, 95%P.UI,50-12,61). W drugiej z 
badanych podgrup - z trzema i więcej poronieniami - wystąpił on w 6,25 VS. 2,07% 
(p=O,l1). Rozkład genotypów heterozygotycznych (w badaniu nie odnotowano żadnej 
pacjentki z genotypem homozygotycznym zmutowanym M) przedstawiał się następująco: 
16,25% w podgrupie z dwoma poronieniami, 12,50% w podgrupie z trzema i więcej oraz 
4,14% w grupie kontrolnej (tab. 15). Różnice statystycznie istotne odnotowano pomiędzy 
podgrupą pacjentek z dwoma poronieniami a grupą kontrolną (p=O,OOI). Nie obserwowano 
znaczących różnic pomiędzy grupą z trzema i czteroma poronieniami a grupą kontrolną. Nie 
zaobserwowano znaczących różnic pomiędzy wartościami obserwowanymi i oczekiwanymi, 
co oznacza zgodność z równowagą Hardy'ego - Weinberga w obrębie badanych 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 53 z 122
		

/p0054.djvu

			polimorfizmów reduktazy metylenotetrahydrofolianowej. 


Tabela 15. Częstość występowania poszczególnych genotypów i alleli polimorfizmu 
1793G> A MTHFR w grupie badanej z dwoma, trzema i więcej oraz grupie kontrolnej. 


67 (83,75) 21 (87,50) 162 (95,86) 
13 (16,25) 3 (12,50) 7 (4,14) 
O (0,00) O (0,00) O (0,00) 
80 (100,00) 24 (100,00) 169 (100,00) 
147 (91,87) 45 (93,75) 331 (97,93) 
13 (8,13) 3 (6,25) 7 (2,07) 
160 (100,00) 48 (100,00) 338 (100,00) 


4.4. Związek badanych wariantów genetycznych z wystąpieniem poronień 
we wczesnym i późnym okresie I trymestru 


W dalszej analizie grupę 104 pacjentek podzielono na pacjentki, u których występowały 
tylko poronienia we wczesnym okresie I trymestru ciąży (6-10 tc, 65 osób, podgrupa A) 
pacjentki, u których występowały tylko poronienia w późnymi okresie I trymestru (11-13 tc., 
16 osób, podgrupa B). Wydzielono również podgrupę kobiet, wśród których odnotowano 
występowanie zarówno poronień we wczesnym, jak i późnym okresie I trymestru (6-12 tc., 
23 osoby, podgrupa C). 


Mutacja Leidell 


W zakresie tego polimorfizmu me zaobserwowano różnic statystycznie istotnych 
pomiędzy podgrupą A (kobiety z poronieniami we wczesnej fazie I trymestru) oraz 
kontrolną zarówno w częstości występowania genotypów typu dzikiego GG (92,31 VS. 
93,45%, p=0,47) jak i genotypu heterozygotycznego GA (7,69 VS. 6,51 %, p=0,47). Wartości 
oczekiwane występowania obydwu rodzajów genotypów były zgodne z prawem Hardy'ego- 
Weinberga. Taką samą obserwację odnotowano w stosunku do alleli (dla allela G: 96,15 VS. 
96,75%, p=0,47; dla allelaA: 3,85 VS. 3,25%, p=0,47). 


Nie zaobserwowano także różnic statystycznie istotnych w zakresie tego polimorfizmu 
pomiędzy grupą B (kobiety z poronieniami pomiędzy 10 a 13 tygodniem ciąży) a grupą 
kontrolną (dla heterozygot GA: 12,50 VS. 6,51%, p=0,31, dla allela A: 6,25 VS. 3,25%, 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 54 z 122
		

/p0055.djvu

			p=0,31) (tab. 16). 
W podgrupie C (kobiet z występowaniem poronień we wczesnym późnym okresie I 
trymestru) odnotowano występowanie tylko osób będących nosicielami genotypu typu 
dzikiego GG. 


Polimorfizm genu protrombiny 


Porównując podgrupę A kobiet z poronieniami we wczesnym okresie I trymestru ciąży z 
grupą kontrolną stwierdzono podobną częstość występowania genotypu GG (98,46 VS. 
98,82%, p=0,62), genotypu GA (1,54 VS. 1,18, p=0,62). Jednocześnie wartości obserwowane 
w częstości występowania obydwu rodzaj ów genotypów były porównywalne z wartościami 
oczekiwanymi i zgodne z prawem Hardy'ego- Weinberga. Również nie odnotowano różnic 
pomiędzy częstością wystąpienia allela G (99,23 VS. 99,41 %, p=0,62) oraz allela A (0,77 VS. 
0,59%, p=0,62) (tab. 16). 
W podgrupie B, kobiet z poronieniami w późnym okresie I trymestru zaobserwowano 
występowanie tylko genotypu typu dzikiego GG. Żadna z badanych 16 osób w tej podgrupie 
nie była nosicielką genotypu heterozygotycznego GA oraz zmutowanego AA. 
W podgrupie C, którą tworzyły kobiety z poronieniami zarówno we wczesnym, jak 
późnym okresie I trymestru ciąży określono występowanie genotypu GG na 91,30% w 
porównaniu do grupy kontrolnej 98,82% (statystycznie nieistotne p=0,07). Zauważono 
jednak znaczną przewagę występowania genotypu GA - 8,70% w porównaniu do grupy 
kontrolnej 1,18%. Obserwowane różnice były jednak statystycznie nieistotne p=0,07. 
Frekwencja zmutowanego allela A wynosiła odpowiednio 4,35% w podgrupie C oraz 
0,59%w grupie kontrolnej zdrowych kobiet (p=0,07). 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 55 z 122
		

/p0056.djvu

			Tabela 16. Częstość występowania poszczególnych genotypów i alleli polimorfizmów 1691G>A i 20210G>A w podgrupach. Podgrupa A - 
pacjentki, u których występowały tylko poronienia we wczesnym okresie I trymestru ciąży, podgrupa B - pacjentki, u których występowały 
tylko poronienia w późnym okresie I trymestru, podgrupa C - kobiety, wśród których odnotowano występowanie zarówno poronień we 
wczesnym, jak i późnym okresie I trymestru. 


60 (92,31) 14 (87,50) 23 (100,00) 158 (93,45) 
5 (7,69) 2 (12,50) O (0,00) 11 (6,51) 
0(0,00) O (0,00) O (0,00) 0(0,00) 
65 (100,00) 16 (100,00) 23 (100,00) 169 (100,00) 
125 (96,15) 30 (93,75) 46 (100,00) 327 (96,75) 
5 (3,85) 2 (6,25) O (0,00) 11 (3,25) 
130 (100,00) 32 (100,00) 46 (100,00) 338 (100,00) 
64 (98,46) 98,46 16 (100,00) 100 21 (91,30) 91,49 167 (98,82) 98,82 
l (1,54) 1,53 O (0,00) O 2 (8,70) 8,32 2 (1,18) 1,17 
0(0,00) 0,01 O (0,00) O O (0,00) 0,19 0(0,00) 0,01 
65 (100,00) 100 16 (100,00) 100 23 (100,00) 100 169 (100,00) 100 
129 (99,23) 32 (100,00) 44 (95,65) 336 (99,41) 
l (0,77) O (0,00) 2(4,35) 2 (0,59) 
130 (100,00) 32 (100,00) 46 (100,00) 338 (100,00) 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 56 z 122
		

/p0057.djvu

			Polimorfizmy genu MTHFR 
W zakresie polimorfizmu 677C> T obserwowano wyższą częstość występowania 
genotypu CC w grupie kontrolnej w porównaniu do podgrupy A (52,66 VS. 36,92%, p=0,02, 
WR=0,52, 95%P.U 0,28-0,98) oraz wyższą częstość występowania genotypu 
heterozygotycznego CT w podgrupie A (52,31 VS. 39,64 %, p=0,05, WR=I,66) oraz 
zmutowanego genotypu TT w podgrupie A (10,77 VS. 7,69%, p=0,30, WR=I,45). 
Obserwowano natomiast różnicę statystycznie istotną w częstości występowania 
zmutowanego allela T (36,92 VS. 27,51 %, p=0,03). Odnotowano brak istotnych statystycznie 
obserwacji pomiędzy częstością występowania genotypów i alleli pomiędzy podgrupą B 
oraz C a grupą kontrolną (tab. 17). 
Dla polimorfizmu 1298A>C me obserwowano zasadniczych różnic w częstości 
występowania badanych genotypów i alleli w podgrupie A oraz kontrolnej (p statystycznie 
nieistotne). Taka sama obserwacja dotyczyła porównania podgrupy B oraz C z grupą 
kontrolną (p statystycznie nieistotne zarówno w zakresie porównania częstości pojawiania 
się badanych genotypów i alleli). 
Ciekawą obserwacją było odnotowanie znacznej przewagi występowania zmutowanego 
genotypu GA polimorfizmu 1793G>A MTHFR w podgrupie kobiet z poronieniami 
pomiędzy 6 a 10 tygodniem ciąży w porównaniu do grupy kontrolnej (15,38 VS. 4,14%, 
p=0,005, WR= 4,21). Obserwacja ta potwierdziła się również w częstości występowania 
zmutowanego allela A w grupie kobiet z poronieniami, wynosiła 7,69% w porównaniu do 
2,07% w grupie kontrolnej (p=0,006, WR=3,94). Brak różnic statystycznie istotnych dla 
polimorfizmu 1793G>A odnotowano przy porównaniu podgrupy B (kobiet z poronieniami 
pomiędzy 11 a 13 tygodniem ciąży) z grupą kontrolną (dla genotypu GA 6,25 VS. 4,14%; 
p=0,52; dla alleli p=0,51). Natomiast istotności statystyczne pojawiły się przy 
porównywaniu podgrupy C (kobiet z obydwoma rodzajami poronień) z grupą kontrolną (dla 
genotypu GA: 21,74 VS. 4,14%; WR=6,43; 95% P.U=I,43-26,05, p=0,007). Dla allela A 
odnotowano przewagę jego występowania 10,87 VS. 2,07%, WR=5,76; 95%P.U=I,37- 
22,06, p=0,008 (tab. 17). 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 57 z 122
		

/p0058.djvu

			Tabela 17. Częstość występowania poszczególnych genotypów i alleli polimorfizmów 677C> T, 1298A>C i 1793G>A genu reduktazy mety1enotetrahydrofolianowej w 
podgrupach. Podgrupa A - pacjentki, u których występowały tylko poronienia we wczesnym okresie I trymestru ciąży, podgrupa B - pacjentki, u których występowały tylko 
poronienia w późnym okresie I trymestru, podgrupa C - kobiety, wśród których odnotowano występowanie zarówno poronień we wczesnym, jak i późnym okresie I trymestru. 


24 (36,92) 9 (56,25) 11 (47,82) 89 (52,66) 
34(52,31) 5 (31,25) 10 (43,48) 67 (39,64) 
7 (10,77) 2 (12,50) 2 (8,70) 13 (7,69) 
65 (100,00) 16 (100,00) 23 (100,00) 169 (100,00) 
82 (63,08) 23 (71,87) 32 (69,57) 245 (72,49) 
48 (36,92) 9 (28,13) 14 (30,43) 93 (27,51) 
130 (100,00) 32 (100,00) 46 (100,00) 338 (100,00) 
26 (40,00) 41,76 6 (37,50) 39,06 8 (34,78) 34,46 78 (46,15) 46,31 
32 (49,23) 45,72 8 (50,00) 46,88 11(47,83) 48,48 74 (43,79) 43,48 
7 (10,77) 12,52 2 (12,50) 14,06 4 (17,39) 17,06 17 (10,06) 10,21 
65 (100,00) 100,00 16 (100,00) 100,00 23 (100,00) 100,00 169 (100,00) 100,00 
84 (64,62) 20 (62,50) 27 (58,70) 230 (68,05) 
46 (35,38) 12 (37,50) 19 (41,30) 108 (31,65) 
130 (100,00) 32 (100,00) 46 (100,00) 338 (100,00) 
55 (84,62) 85,21 15 (93,75) 93,84 18 (78,26) 79,44 162 (95,86) 95,91 
10 (15,38) 14,20 l (6,25) 6,06 5 (21,74) 19,38 7 (4,14) 4,05 
O (0,00) 0,59 O (0,00) 0,10 O (0,00) 1,18 O (0,00) 0,04 
65 (100,00) 100,00 16 (100,00) 100,00 23 (100,00) 100,00 169 (100,00) 100,00 
120 (92,31) 31 (96,88) 41 (89,13) 331 (97,93) 
10 (7,69) 1(3,13) 5(10,87) 7 (2,07) 
130 (100,00) 32 (100,00) 46 (100,00) 338 (100,00) 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 58 z 122
		

/p0059.djvu

			4.5. Współwystępowanie genotypów czynnika V Leiden oraz 20210G>A 
protrombiny w grupie kobiet z dwoma i więcej poronieniami oraz w 
grupie kontrolnej 


W następnym etapie pracy badano współwystępowanie uzyskanych w pracy genotypów 
badanych polimorfizmów genów czynnika V i II krzepnięcia krwi. 
Porównując genotypy polimorfizmów 1691G>A czynnika V Leiden z polimorfizmem 
20210G>A genu protrombiny pomiędzy grupą 104 kobiet z dwoma poronieniami a grupą 
kontrolną 169 kobiet zaobserwowano jeden przypadek pacjentki nosicielki 
heterozygotycznych genotypów dla obu porównywanych polimorfizmów w grupie kobiet z 
poronieniami (0,96 VS. 0,00%; p=0,57) różnica nie była istotna statystycznie. W całej 
badanej grupie nie znaleziono genotypów homozygotycznych zmutowanych dla 
polimorfizmów 1691G>A genu czynnika V oraz 20210G>A genu protrombiny. 
Występowanie pozostałych genotypów i alleli porównywanych polimorfizmów było 
podobne do grupy kontrolnej (dla genotypu GGI GG 91,35: 92,31 %, dla genotypu GAIGG 
5,77: 6,51%, GGIGA 1,92: 1,18%) (tab. 18). 


Tabela 18. Współwystępowanie genotypów 1691G>A czynnika V oraz 20210G>A genu 
protrombiny między całą grupą badaną kobiet z poronieniami oraz grupą kontrolną. 


95 (91,35) 6(5,77) O (0,00) 101 (97,12) 
2 (1,92) l (0,96) O (0,00) 3 (2,88) 
0(0,00) 0(0,00) O (0,00) O (0,00) 
97 (93,27) 7(6,73) O (0,00) 104 (100,00) 
156 (92,31) 11 (6,51) O (0,00) 167 (98,82) 
2 (1,18) 0(0,00) O (0,00) 2 (1,18) 
0(0,00) 0(0,00) O (0,00) O (0,00) 
158 (93,49) 11 (6,51) O (0,00) 169 (100,00) 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 59 z 122
		

/p0060.djvu

			4.6. Współwystępowanie genotypów 677C>T, 1298A>C i 1793G>A w 
grupie kobiet z dwoma i więcej poronieniami oraz w grupie kontrolnej 


Analizując współwystępowanie genotypów MTHFR zwrócono uwagę na znaczną, 
statystycznie istotną przewagę występowania heterozygot CTIAC (67711298 MTHFR). W 
grupie kobiet z poronieniami (28,85 VS. 15,98%, WR=2,33; 95%P.U=I,03-5,34; p=0,02) 
(tab. 19). Jak również statystycznie istotną przewagę pojawienia się heterozygotycznych 
genotypów ACIGA (1298/1793 MTHFR) (12,50 VS. 3,55%; WR=3,87; 95%P.U=I,24-13,35; 
p=0,008) (tab. 20). 
Interesującą obserwacją była obecność współwystępowania genotypów heterozygotycznych 
CTIGA (677/1793 MTHFR) w grupie kobiet z poronieniami aż w 9,61% podczas gdy nie 
występowały one w grupie kontrolnej (p=0,02). Nie stwierdzono obecności korelacji 
genotypów zmutowanych TTICC (677/1298 MTHFR) , CCIM (1298/1793 MTHFR) oraz 
TTIAA (677/1793 MTHFR) zarówno w grupie badanej, jak i kontrolnej (tab. 18, 19,20). 


Tabela 19. Współwystępowanie genotypów 677C> T oraz 1298A>C genu MTHFR między 
całą grupą badaną kobiet z poronieniami oraz grupą kontrolną. 


10 (9,61) 19 (18,27) 11 (10,58) 40 (38,46) 
21 (20,19) 30 (28,85) O (0,00) 51 (49,04) 
13 (12,50) O (0,00) O (0,00) 13 (12,50) 
44 (42,31) 49 (47,11) 11 (10,58) 104 (100,00) 
25 (14,79) 40 (23,67) 13 (7,69) 78 (46,15) 
47 (27,81) 27 (15,98) O (0,00) 74 (43,79) 
17 (10,06) O (0,00) O (0,00) 17 (10,06) 
89 (52,66) 67 (39,65) 13 (7,69) 169 (100,00) 


Tabela 20. Współwystępowanie genotypów 1298A>C oraz 1793G>A genuMTHFR między 
całą grupą badaną kobiet z poronieniami oraz grupą kontrolną. 


40(38,46) 38 (36,54) 10 (9,62) 88 (84,62) 
0(0,00) 13 (12,50) 3 (2,88) 16 (15,38) 
0(0,00) O (0,00) O (0,00) O (0,00) 
40 (38,46) 51 (49,04) 13 (12,50) 104 (100,00) 
78 (46,15) 68 (40,24) 16 (9,47) 162 (95,86) 
0(0,00) 6 (3,55) l (0,59) 7 (4,14) 
O (0,00) O (0,00) O (0,00) O (0,00) 
78 (46,15) 74 (43,79) 17 (10,06) 169 (100,00) 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 60 z 122
		

/p0061.djvu

			Tabela 21. Współwystępowanie genotypów 677C>T oraz 1793G>A genuMTHFR między 
całą grupą badaną kobiet z poronieniami oraz grupą kontrolną. 


38 (36,54) 39 (37,50) 11 (10,58) 88 (84,62) 
6 (5,77) 10 (9,61) O (0,00) 16 (15,38) 
O (0,00) O (0,00) O (0,00) 0(0,00) 
44 (42,31) 49 (47,11) 11 (10,58) 104 (100,00) 
82 (48,52) 67 (39,65) 13 (7,69) 162 (95,86) 
7 (4,14) O (0,00) O (0,00) 7 (4,14) 
O (0,00) O (0,00) O (0,00) 0(0,00) 
89 (52,66) 67 (39,65) 13 (7,69) 169 (100,00) 


4.7. Porównanie częstości występowania haplotypów genu MTHFR w 
grupie kobiet z dwoma i więcej poronieniami oraz w grupie kontrolnej 


Na podstawie otrzymanych w badaniu genotypów polimorfizmów reduktazy 
metylenotetrahydrofolianowej obliczono za pomocą programu PHASE frekwencje 
poszczególnych hapl otyp ów. Wyniki obliczone przez program przedstawia tabela 22. 
W kolumnie "haplotyp" litery oznaczają odpowiednio: pierwsza - allel polimorfizmu 
677C>T, druga - polimorfizmu 1298A>C i trzecia polimorfizmu 1793G>A. Wyznaczono 
obecność siedmiu haplotypów (TAG, CAG, CCG, CCA, TCG, TCA, CM) występujących 
pośród badanych kobiet spośród możliwych ośmiu kombinacji. Nie zaobserwowano 
istotnych statystycznie różnic w częstości występowania poszczególnych haplotypów 
pomiędzy grupą kobiet z dwoma i więcej poronieniami i grupą kontrolną (p=0,07). 
Zauważono jednak tendencję do częstszego występowania haplotypów CCA, TCG, TCA 
(zawierających dwa lub trzy zmutowane warianty) oraz TAG z jednym zmutowanym 
wariantem dla polimorfizmu 677C> T w grupie kobiet z poronieniami (0,3152 VS. 0,2745). 
W grupie kontrolnej częściej występującymi haplotypami okazały się CAG, CCG, CM 
(zawierające tylko jeden zmutowany wariant lub wszystkie warianty typu dzikiego) (tab. 22, 
ryc. 7). 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 61 z 122
		

/p0062.djvu

			Tabela 22. Ocena częstości występowania poszczególnych haplotypów badanych 
polimorfizmów genu MTHFR dokonana za pomocą programu PRASE. 


0,3152 0,000456 0,2745 0,000343 
0,3123 0,000455 0,4033 0,000378 
0,2781 0,000440 0,3008 0,000353 
0,0663 0,000244 0,0181 0,000103 
0,0174 0,000128 0,0006 0,000019 
0,0084 0,000090 0,0000 0,000000 
0,0019 0,000043 0,0026 0,000039 


0,5 
0,4 
0,3 
0,2 
0,1 
O 
TAG 


. 
2 poronienia . grupa kontrolna 


CAG 


CCG 


CCA 


TCG 


TCA 


CAA 


Ryc. 8. Częstość występowania haplotypów polimorfizmów MTHFR. 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 62 z 122
		

/p0063.djvu

			5. DYSKUSJA 


W ostatnich latach obserwuje SIę wzrost zainteresowania możliwym związkiem 
trombofilii z poronieniami nawracającymi, stanem przedrzucawkowym, przedwczesnym 
oddzieleniem się łożyska, wewnątrzmacicznym zahamowaniem wzrostu płodu oraz 
wewnątrzmacicznym zgonem płodu. Wiele badań dowodzi, że nieprawidłowa implantacja i 
zmiany we wczesnym okresie ciąży leżą u podstaw niepomyślnych wyników we wszystkich 
trzech trymestrach ciąży (ryc. 9). 


Ryc. 9. Niepomyślne zakończenie ciąży [wg Rai i Regan, 2006]. 
Zgodnie z Rekomendacjami Polskiego Towarzystwa Ginekologicznego dotyczącymi 
postępowania w zakresie patologii wczesnej ciąży u wszystkich kobiet z powtarzającymi się 
poronieniami należy przeprowadzić wywiad w kierunku trombofilii, obejmujący 
występowanie żylnej choroby zakrzepowo-zatorowej, udarów, choroby wieńcowej oraz 
zawałów, zarówno u pacjentki, jak i u jej krewnych pierwszego stopnia. Dodatni wywiad 
obliguje do wykonania badań w kierunku mutacji typu Leiden czynnika V, mutacji genu 
protrombiny, aktywności antytrombiny III, białka C i białka S [Rekomendacje PTG, 2008]. 
Patogeneza poronień nawracających u kobiet z trombofilią nie jest dokładnie wyjaśniona. 
Niektóre badania nie wykazują ścisłej korelacji pomiędzy wrodzoną trombofilią matki a 
obecnością zawałów, zakrzepów czy odkładaniem się fibryny w łożysku [Mousa i wsp., 
2000; Sikkema i wsp., 2002]. Nadal otwartym pozostaje pytanie czy proces zakrzepowy jest 
rzeczywiście przyczyną czy stanowi zjawisko wtórne w poronieniach związanych z 
trombofilią. Z drugiej strony badania kliniczne wskazują, że działanie antykoagulacyjne 
heparyny może w sposób istotny zmniej szyć częstość występowania poronień u kobiet z 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 63 z 122
		

/p0064.djvu

			wrodzoną trombofilią [Brenner i wsp., 2005; Gris i wsp., 2004; Carp i wsp., 2003; Sanson i 
wsp., 1999]. Trwa debata mająca na celu wyjaśnienie etiologii poronień związanych z 
trombofilią, jak również kryteriów określających ryzyko utraty ciąży u kobiet nosicielek 
wrodzonych trombofilii. Niezbędne jest także oszacowanie równowagi pomiędzy 
korzyściami a ryzykiem profilaktyki antykoagulacyjnej podczas ciąży oraz konieczności 
stosowania tej profilaktyki w grupie kobiet z wywiadem obciążonym występowaniem 
poronień nawracających [Lindqvist i wsp., 2005; Walker i wsp., 2005; Gris i wsp., 2005]. 


5.1. Polimorfizmy genów czynnika V i protrombiny jako czynniki ryzyka 
występowania poronień nawracających 


5.1.1. Czynnik V Leiden 


Mutacje FVL i 20210G>A protrombiny powodują około trzykrotny (z 6% do około 16%) 
wzrost ryzyka wystąpienia późnych utrat ciąży u nosicielek mutacji w porównaniu z 
nosicielkami prawidłowych wariantów tych genów [Martinelli i wsp., 2000]. Obecnie 
większość badań potwierdza, że występowanie mutacji FVL powoduje zwiększenie ryzyka 
wystąpienia poronień w drugim trymestrze ciąży oraz ryzyka wewnątrzmacicznego 
obumarcia płodu. Niewiele badań dotyczy znaczenia mutacji Leiden oraz mutacji PTM w 
stosunku do poronień w pierwszym trymestrze ciąży [Dizon-Townson i wsp., 1997; 
Grandone i wsp., 1997; Ridker i wsp., 1998; Tormene i wsp., 1999; Meinardi i wsp., 1999]. 
Wyniki prac badających związek mutacji Leiden czynnika V z poronieniami nawracającymi 
nie sąjednoznaczne. U wielu kobiet nosicielek mutacji FVL ciąża kończy się sukcesem i nie 
towarzysząjej żadne powikłania. Prawdopodobnie ryzyko poronienia jest dużo większe, gdy 
mutacji Leiden u matki towarzyszą inne czynniki związane z powstawaniem zakrzepów. 
Teorię tę potwierdzają badania poronień na znokautowanych (ang. knockout) modelach 
zwierzęcych głównie przeprowadzanych na myszach ze względu na występowanie u nich 
krwiokosmówkowego łożyska. Podobnie jak u człowieka genotyp heterozygotyczny FVL u 
myszy związany jest z występowaniem trombofilii, lecz nie koreluje z wewnątrzmacicznym 
obumarciem płodu lub osłabioną płodnością obrosłych żeńskich osobników mysich [Cui, 
2000]. Natomiast obserwacje zwierząt pozbawionych składników receptorowych dla szlaku 
antykoagulacyjnego białka C: trombomoduliny (TM) i śródbłonkowego receptora białka C 
(EPCR) (knockout) wykazują, że prawidłowe działanie tego szlaku jest niezbędne dla 
rozwoju ciąży [Isermann, 2001; Isermann, 2003; Li, 2005]. Myszy z wyłączonym genem 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 64 z 122
		

/p0065.djvu

			TM lub EPCR umierały we wczesnej ciąży przy czym obserwowano również uszkodzenia 
łożyska. Li i wsp. (2005) przedstawili, że poronienia u pozbawionych EPCR zarodków 
mysich spowodowane są niezdolnością trofoblastu do zapobiegania zakrzepicy 
zainicjowanej przez czynnik tkankowy w naczyniach łożyska. Przywrócenie ekspresji TM 
lub EPCR głównie w łożysku pozwala płodom rozwijać się prawidłowo. Zgromadzone na 
powierzchni komórek białko C pełni rolę pośredniego czynnika wzrostu dla trofoblastu a 
jego niedobór prowadzi do zaburzeń wzrostu płodu, miejscowego wzrostu aktywności 
krzepnięcia i gromadzenia produktów rozpadu fibryny, co powoduje obumarcie komórek 
trofoblastu [Isermann i wsp., 2003]. Sood i wsp. badali utraty ciąż u myszy. W stworzonym 
przez nich modelu obecność mutacji FVL u matki zbiegała się z obecnością 
nieprawidłowych genów ograniczających aktywację szlaku antykoagulacyjnego białka C w 
obrębie łożyska u płodu. Autorzy zaobserwowali, że nieprawidłowości genów płodu 
powodowały wzrost ryzyka wystąpienia poronień u matek nosicielek FVL oraz istnienie 
szlaku niezależnego od trombofilii za pośrednictwem aktywacji matczynych płytek [Sood i 
wsp., 2007]. 


Prace potwierdzające związek mutacji czynnika V Leiden z występowaniem poronień 
nawracaj ących 


Wiele prac wskzuje na ścisły zwiążek występowania mutacji Leiden z poronieniami. Już 
w badaniu opublikowanym w 1996 roku Rai i wsp. wykazali związek oporności na 
aktywowane białko C z poronieniami u kobiet w drugim trymestrze ciąży. Autorzy ci nie 
sprawdzali natomiast obecności mutacji FVL w badanej grupie kobiet. Również u 120 
angielskich kobiet z poronieniami nawracającymi w wywiadzie oraz bez objawów choroby 
zakrzepowo - zatorowej zbadano oporność na zaktywowane białko C. Siedemdziesiąt z tych 
kobiet doświadczyło utraty ciąży tylko w pierwszym trymestrze ciąży, a u 50 kobiet 
poronienia występowały zarówno w pierwszym, jak i w drugim trymestrze ciąży. Przewaga 
częstości występowania oporności na zaktywowane białko C była wyższa u kobiet z 
poronieniami w drugim trymestrze ciąży (10/50, 20%) w porównaniu do kobiet z 
poronieniami występującymi w pierwszym trymestrze ciąży (4/70, 5,7%). Częstość 
występowania oporności w dobranej wiekowo grupie kontrolnej była podobna do częstości 
występowania w populacji ogólnej (3/70, 4,3%). Autorzy wnioskowali, że oporność na 
zaktywowane białko C może być odpowiedzialna za poronienia występujące w drugim 
trymestrze ciąży [Rai i wsp., 1996]. W kolejnym badaniu Grandone i wsp. zbadali 43 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 65 z 122
		

/p0066.djvu

			włoskie kobiety z dwoma lub więcej ni ewy jaśnionymi utratami ciąży. Mutację czynnika V 
Leiden znaleziono u 7 z 43 pacjentek (16,28%) oraz u 5 ze 118 kobiet z grupy kontrolnej 
(4,24%). Wśród 16 kobiet z wewnątrzmacicznym obumarciem płodu 5 pacjentek (31,25%) 
było nosicielkami mutacji. Dwie z 27 kobiet, które poniosły utratę ciąży w pierwszym 
trymestrze ciąży (7,41%) były nosicielkami mutacji. Częstość występowania mutacji 
czynnika V Leiden była znacząco wyższa wśród kobiet z poronieniami nawracającymi, 
obecność mutacji głównie korelowała z późnymi poronieniami [Grandone i wsp., 1997]. 
Podobnie Ridker i wsp. opublikowali badanie 113 przeprowadzone wśród białych kobiet 
amerykańskich z trzema lub więcej ni ewy jaśnionymi poronieniami w wywiadzie. Szesnaście 
z 437 kobiet (3,7%) z grupy kontrolnej było nosicielkami mutacji czynnika V Leiden oraz 9 
z 113 kobiet z grupy badanej (8%). Autorzy zasugerowali, że mutacja czynnika V Leiden 
może pełnić rolę w niektórych przypadkach "ni ewy jaśnionych" poronień nawracających 
[Ridker i wsp., 1998]. 
Brenner i wsp. opublikowali wyniki badań dotyczące 76 izraelskich kobiet z 
ni ewy jaśnionymi poronieniami w wywiadzie. Sprawdzali oni trzy często występujące 
polimorfizmy warunkujące występowanie wrodzonej trombofilii, w tym również mutację 
Leiden. Kryteria włączenia kobiet do grupy badanej przez nich to trzy lub więcej poronienia 
w pierwszym trymestrze ciąży (7-12 tydzień ciąży), dwa lub więcej poronienia w drugim 
trymestrze ciąży lub wewnątrzmaciczne obumarcie płodu w wywiadzie. Do badania 
włączono tylko przypadki poronień już po utworzeniu zarodka. Kobiety z 
udokumentowanymi poronieniami przedklinicznymi w pierwszym trymestrze ciąży, pustym 
jajem płodowym i utratami ciąży spowodowanymi wadami rozwojowymi lub infekcjami 
zostały wyłączone z badania. Dwadzieścia cztery z 76 kobiet (32%) wykazywało obecność 
mutacji Leiden w porównaniu do 11 z 106 (10%) kobiet z grupy kontrolnej. Pięć z 76 
pacjentek (7%) było nosicielkami genotypu homozygotycznego zmutowanego, który nie 
wystąpił u żadnej pacjentki z grupy kontrolnej. Badanie to wskazuje, że istnieje ścisły 
związek pomiędzy mutacją czynnika V Leiden i poronieniami nawracającymi [Brenner i 
wsp., 1999a]. 
Kolejne badanie 56 brazylijskich kobiet z trzema lub więcej poronieniami zostało 
opublikowane przez Souza i wsp. Grupa badana obejmowała 46 pacjentek z pierwotnymi 
poronieniami (nigdy nie urodziły żywego dziecka) oraz 10 pacjentek, które urodziły żywe 
dziecko przed doświadczeniem poronień. Mutację czynnika V Leiden znaleziono u 4 z 56 
pacjentek (7,1%) i u 6 z 384 w grupie kontrolnej (1,6%). Również w tym badaniu wykazano 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 66 z 122
		

/p0067.djvu

			związek pomiędzy występowaniem mutacji a poronieniami nawracającymi [Souza i wsp., 
1999]. 
Meinardi i wsp. badali przyczyny utraty płodów u 228 kobiet z mutacją Leiden oraz u 121 
kobiet z grupy kontrolnej z prawidłowym wariantem genu czynnika V. Poronienia 
definiowali jako utraty przed 20 tygodniem ciąży, a wewnątrzmaciczne obumarcia płodu 
jako utratę ciąży po 20 tygodniu. Prawie 32% nosicielek mutacji i 22% kobiet z grupy 
kontrolnej doświadczyło utrat płodów. Oceniono, że nosicielki mutacji mają 29,4% szans na 
wystąpienie poronienia vs. 17,4% u kobiet z prawidłowym wariantem czynnika V. Szanse 
wystąpienia wewnątrzmacicznego obumarcia płodu były podobne w obu grupach i wynosiły 
odpowiednio 5,7% 5,0%.Zasugerowano również, że pacjentki o genotypie 
homozygotycznym zmutowanym posiadają większe ryzyko utraty ciąży w porównaniu do 
kobiet o genotypie heterozygotycznym. Badacze ci zasugerowali, że wewnątrzmaciczne 
obumarcia płodów i poronienia występują częściej u nosicielek mutacji czynnika V Leiden 
[Meinardi i wsp., 1999]. 
y ounis i wsp. opublikowali badanie 78 zdrowych kobiet izraelskich z dwoma lub więcej 
następującymi po sobie ni ewy jaśnionymi poronieniami w pIerwszym lub w drugim 
trymestrze ciąży. Kobiety podzielono na trzy grupy: A - zawierającą 37 kobiet z 
nawracającymi poronieniami w pierwszym trymestrze ciąży, B - 41 kobiet z co najmniej 
jednym poronieniem w drugim trymestrze ciąży i C - grupę kontrolną. U wszystkich kobiet 
badano występowanie oporności na zaktywowane białko C. Pacjentki, u których 
stwierdzono występowanie oporności na aktywowane białko C miały wykonywane badanie 
mutacji czynnika V Leiden. Oporność na aktywowane białko C i mutacja Leiden znacznie 
częściej występowały w grupach A i B w porównaniu z grupą C. Wartości te wynosiły 
odpowiednio 27%, 49% i 8% dla oporności na zaktywowane białko C oraz 16%, 22% i 6% 
dla występowania mutacji Leiden. Autorzy ci wskazali, że oporność na APC i mutacja 
czynnika V Leiden prawdopodobnie mają wpływ na poronienia nawracające zarówno w 
pierwszym, jak i w drugim trymestrze ciąży [Y ounis i wsp., 2000]. 
Wramsby i wsp. badali 84 szwedzkie kobiety z przynajmniej trzema następującymi po sobie 
ni ewy jaśnionymi poronieniami w wywiadzie (32 kobiety z wtórnymi, 52 kobiety z 
poronieniami pierwotnymi). U kobiet z poronieniami nawracającymi mutacja Leiden 
występowała znacznie częściej w porównaniu z grupą kontrolną (13/84 vs. 2/69; p=0,0077). 
Dwanaście (27,8%) kobiet z poronieniami pierwotnymi było nosicielkami mutacji FVL VS. l 
pacjentka z poronieniami wtórnymi. W pracy badano występowanie innych klinicznych 
nieprawidłowości, które mogły wpłynąć na występowanie poronień u kobiet z grupy 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 67 z 122
		

/p0068.djvu

			badanej. Stwierdzono występowanie takich nieprawidłowości u 22 pacjentek. W grupie 36 
pacjentek, u których występowały poronienia pierwotne i nie stwierdzono żadnych innych 
nieprawidłowości mogących być przyczyną ich występowania, nosicielkami FVL było 10 
(27,8%) kobiet (10/36 VS. 2/69, p=O,0003) [Wramsby i wsp., 2000]. 
Foka i wsp. badając 80 greckich pacjentek z dwoma lub więcej poronieniami bez 
potwierdzonej innej przyczyny, stwierdził że 15 z 80 pacjentek (19%) i 4 ze 100 z grupy 
kontrolnej (4%) były nosicielkami mutacji Leiden czynnika V krzepnięcia krwi. Dziewięć z 
61 kobiet z poronieniami w pierwszym trymestrze ciąży (14,7%) posiadało genotyp 
heterozygotyczny FVL i 6 z 19 kobiet z poronieniami w drugim trymestrze ciąży (31,5%). 
Badacze ci wnioskują, że mutacja Leiden czynnika V jest związana z poronieniami 
nawracającymi z większą przewagą w grupie kobiet z poronieniami w drugim trymestrze 
ciąży. Badanie to jednak obarczone błędem ponieważ 6 z 15 kobiet z mutacją czynnika V 
Leiden posiadało inne nieprawidłowości zakrzepowe, które mogły być odpowiedzialne za 
poronienia [Foka i wsp., 2000]. 
Reznikoff-Etievant i wsp. badali 260 białych kobiet, które doświadczyły dwóch lub więcej 
ni ewy jaśnionych poronień przed 10 tygodniem ciąży. Do badania zakwalifikowywano 
również pacjentki z obecnością pustego jaja płodowgo. Dwadzieścia siedem pacjentek 
(10,3%) było nosicielkami mutacji czynnika V Leiden w porównaniu do 11 kobiet w grupie 
kontrolnej (4,6%). Autorzy sugerowali, że mutacja czynnika V Leiden wpływa znacząco na 
poronienia nawracające przed 10 tygodniem ciąży [Reznikoff-Etievant i wsp., 2001]. 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 68 z 122
		

/p0069.djvu

			Tabela 23. Badania potwierdzające związek pomiędzy mutacją czynnika V Leiden 
. o. o. 
poromemaml nawracaj ącymI 


południowo 16,3 (7/43) 4,2 (5/118) 0,01 4,39 (1,3-14,7) 
włoska 
amerykańska 8,0 (9/113) 3,7 (16/437) 0,05 2,3 (1,0-5,2) 
(kaukaska) 
32,0 (24/76) 10,0 (11/106) <0,001 4,0 (1,8-8,8) 
7, l (4/56) 1,6 (6/384) 4,9 (1,3-17,8) 
skandynawska 31,6 (72/228) (a) 22,3 (27/121) (a) 0,06 2,12 (1,35-3,33) 
29,4 (67/228) (b) 17,4 (21/121) (b) 2,08 (1,33-3,25) 
19,0 (15/78) 6,0 (8/139) <0,05 3,17 (1,03-9,8) 
szwedzka 15,5 (13/84) 2,9 (2/69) 0,0077 
19,0 (15/80) 4,0 (4/100) 0,003 5,5 (1,7-17) 
francuska 10,3 (27/260) 4,6 (11/240) 0,018 2,4 (1-5) 


(a)-pierwszy trymestr; (b )-drugi trymestr. 


Prace nie potwierdzające związku mutacji czynnika V Leiden z występowaniem 
poronień nawracających 


Chociaż wcześniej wymIemane badania potwierdzają związek mutacji Leiden z 
poronieniami nawracającymi inne badania sugerują brak takiego związku. Preston i wsp. 
badał związek pomiędzy utratami płodu i trombofilią u kobiet uczestniczących w badaniu 
EPCOT (European Prospectżve Cohort on Thrombophżlża). 843 kobiet z 1384 kobiet w 
analizie EPCOT było nosicielkami mutacji czynnika V Leiden oraz wykazywało niedobór 
antytrombiny III, białka S lub białka C. U 571 z tych kobiet stwierdzono obecność 1524 ciąż 
w wywiadzie. W grupie badanej nosicielkami FVL było 141 kobiet i stwierdzono u nich 
łącznie 378 ciąż. Pię ciąż zakończyło się wewnątrzmacicznym obumarciem płodu i 48 ciąż 
zakończyło się poronieniami powyżej 28 tygodnia ciąży. Nie zaobserwowano znaczących 
statystycznie różnic pomiędzy nosicielkami mutacji czynnika V Leiden i kobietami z grupy 
kontrolnej. Autorzy nie wykazali związku obecności mutacji FVL z poronieniami w I i II 
trymestrze ciąży, sugerują oni związek mutacji tylko z wewnątrzmacicznym obumarciem 
płodu [Preston i wsp., 1996]. Jednak Younis i wsp. (2000) sugerują, że wnioski uzyskane w 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 69 z 122
		

/p0070.djvu

			tym retrospektywnym badaniu były niewłaściwe. W badaniu EPCOT analizowano historię 
położniczą kobiet nosicielek mutacji FVL, a możliwym jest, że tylko niektóre z kobiet 
nosicielek mutacji FVL doświadczają poronień nawracających. Podobne obserwacje 
opisywano dla zespołu antyfosfolipidowego [Brenner i wsp., 1997]. Chociaż jest on 
uznawanym czynnikiem związanym z poronieniami nawracającymi większość pacjentek z 
zespołem APS nie doświadcza niekorzystnych powikłań w przebiegu ciąży [Brenner i wsp., 
1997; Girling i wsp., 1997]. 
Dizon-Townson i wsp. badali 40 par z trzema lub więcej idiopatycznymi poronieniami. 
Mutacja Leiden występowała u 3% całej badanej przez nich populacji [Dizon- Townson i 
wsp., 1997b]. Grupa badana zawierała 22 kobiety z poronieniami tylko w pierwszym 
trymestrze ciąży i 18 kobiet z poronieniami drugim trymestrze ciąży. Pacjentki z grupy 
badanej i kontrolnej były rasy białej. Wyniki wykazały, że żadna z 40 pacj entek z 
idiopatycznymi poronieniami nawracającymi nie była nosicielką mutacji Leiden w 
porównaniu do jednej osoby - partnera jednej z 40 pacjentek (2%). Żadna z kobiet z grupy 
kontrolnej nie była nosicielką mutacji. Autorzy wnioskują, że mutacja czynnika V Leiden 
nie występuje często w opisywanej przez nich populacji z poronieniami nawracającymi. 
Badanie to jednak wydaje się być obarczone błędem ponieważ mutacja była w nim mniej 
częsta zarówno w grupie badanej, jak i kontrolnej niż obserwowana normalnie w populacji 
ogólnej, co mogło być spowodowane małą ilością osób w badanych grupach [Dizon- 
Townson i wsp., 1997]. 
Balasch i wsp. opublikowali badanie 55 hiszpańskich kobiet z dwoma lub WIęcej 
ni ewy jaśnionymi poronieniami w pierwszym trymestrze ciąży i 50 dobranych wiekowo 
kobiet stanowiących grupę kontrolną. U 8 z 55 pacjentek wystąpiły wtórne poronienia, a u 
47 z nich poronienia pierwotne. Mierzono również oporność na zaktywowane białko C u 
wszystkich kobiet i sprawdzano genotyp na obecność mutacji Leiden u pacjentek, u których 
wystąpiła oporność APC. Zaobserwowano oporność APC u jednej kobiety z grupy badanej i 
u jednej z grupy kontrolnej. Obydwi e pacj entki posiadały genotyp heterozygotyczny. 
Autorzy stwierdzili, że poronienia w pierwszym trymestrze ciąży nie są związane z 
występowaniem oporności na zaktywowane białko C [Balasch i wsp., 1997]. W 1999 roku 
Coumans i wsp. zaproponowali wytłumaczenie dlaczego poronienia w pierwszym 
trymestrze ciąży przypuszczalnie nie są związanie z opornością na zaktywowane białko C 
(APC resistance). Autorzy ci sugerują, że związana z ciążą oporność na APC rozwija się 
głównie po 14 tygodniu ciąży i jest najbardziej widoczne blisko jej zakończenia [Coumans i 
wsp., 1999]. 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 70 z 122
		

/p0071.djvu

			W 1999 roku Kuttach i wsp. opisał 50 białych kobiet mieszkających w Tennessee 
(środkowo-wschodni region USA), u których wystąpiły trzy lub więcej poronienia. U 
wszystkich zbadano mutację Leiden czynnika V, mutację genu protrombiny oraz MTHFR 
(677C>1). Zanotowano 206 poronień, z których 189 wystąpiło przed ukończeniem 12 
tygodnia ciąży. U 28 pacjentek wystąpiły pierwotne poronienia, a u 22 wtórne. Jedna z 
pacjentek i dwie kobiety z grupy kontrolnej były nosicielkami genotypu heterozygotycznego 
mutacji Leiden. Autorzy stwierdzili, że mutacja czynnika V Leiden nie występuje częściej u 
kobiet z poronieniami nawracającymi we wczesnym okresie ciąży [Kuttach i wsp., 1999]. 
Pauer i wsp. porównywali częstość występowania mutacji Leiden u 84 niemieckich kobiet z 
dwoma lub WIęcej poronieniami (64 w pierwszym trymestrze ciąży i 20 w drugim 
trymestrze). Około 11% pacjentek (9/84) i 9,2% w grupie kontrolnej (8/87) było 
nosicielkami mutacji Leiden. Sześć z 64 pacjentek z poronieniami w pierwszym trymestrze 
ciąży (9,4%) było nosicielkami mutacji oraz trzy z 20 pacjentek z poronieniami w drugim 
trymestrze ciąży (15%). Badacze wnioskują, że czynnik V Leiden nie wpływa na wczesne 
poronienia nawracające, chociaż może mieć wpływ na poronienia późniejsze [Pauer i wsp., 
1998]. 
Hashimoto i wsp. badali obecność mutacji Leiden u 52 japońskich kobiet z trzema lub 
więcej następuj ącymi po sobie niewyj aśnionymi poronieniami w pierwszym trymestrze 
ciąży oraz 41 partnerów tych kobiet. W tym badaniu żadna z osób nie posiadała mutacji 
Leiden. Badanie grupy kontrolnej dało taki sam wynik. Badacze stwierdzili, że mutacja 
FVL nie jest związana z poronieniami nawracającymi w populacji japońskiej. Odnotowania 
wymaga jednak fakt, że mutacja ta występuje niezmiernie rzadko u Azjatów «1%) 
[Hashimoto i wsp., 1999]. 
Roque i wsp. donoszą, że u 491 kobiet z poronieniami nawracającymI w pIerwszym 
trymestrze ciąży badali przeciwciała antyfosfolipidowe, mutację Leiden czynnika V, genu 
protrombiny (20210G>A), hiperhomocysteinemię oraz niedobory białka S, białka C 
antytrombiny III. W badaniu uzyskano różnice w częstości występowania wczesnych 
późnych poronień w I trymestrze ciąży pomiędzy kobietami z trombofilią i bez mutacji. U 
kobiet bez trombofilii częstość występowania poronień przed 10 tygodniem I trymestru 
ciąży wynosiła 63,9%, natomiast u pacjentek ze stwierdzoną trombofilią tylko 36,4% 
poronień występowało przed 10 tygodniem ciąży. Autorzy zgadzają się z wnioskami z 
metaanalizy Rai i wsp. (2003), że u kobiet nosicielek FVL w I trymestrze ciąży może 
następować wzrost częstości występowania poronień dopiero po 10 tygodniu. Sugerują, że 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 71 z 122
		

/p0072.djvu

			przed tym okresem FVL pełni paradoksalnie funkcję ochronną przed poronieniami [Roque i 
wsp.,2004]. 


Tabela 24. Badania nie potwierdzające związku pomiędzy mutacją czynnika V Leiden i 
. o. o. 
poromemaml nawracającymI. 


26,9 (38/141) 23,5 (93/395) 0,04 0,9 (0,5-1,5) 
amerykańska 
(główni a 0,0 (0/40) 0,0 (0/25) 
kaukaska) 
1,8 (1/55) 2,0 (1/50) (0,5-5,5) 
amerykańska 2,0 (1/50) 4,0 (2/50) 0,49 (0,04-5,58) 
(kaukaska) 
niemiecka 10,7 (9/84) 9,2 (8/87) 
0,0 (0/52) 0,0 (0/55) 


W powyższym badaniu wyniki sugerują słaby, aczkolwiek możliwy wpływ mutacji 
Leiden na występowanie poronień nawracających w I trymestrze ciąży. W prezentowanej 
pracy badano grupę 104 kobiet rasy kaukaskiej, narodowości polskiej z dwoma lub więcej 
poronieniami w I trymestrze ciąży (6 do 13 t.c.). Podobnie jak w pracach Brennera i wsp. 
(1999a) oraz Younis i wsp. (2000) wykluczono u nich inne patologie położnicze mogące 
mieć związek z występowaniem powikłań zakrzepowych oraz inne przyczyny poronień 
nawracających (nieprawidłowości chromosomalne, zaburzenia hormonalne, choroby ogólne 
matki, wady macicy), jak również wykluczono obecność przeciwciał antyfosfolipidowych. 
Występowanie genotypów GG oraz GA mutacji FVL było podobne zarówno w grupie 
badanej, jak i kontrolnej (169 osób) i wynosiły odpowiednio dla genotypu GG 93,27: 
93,49%, WR=0,69, p=0,56, a dla genotypu GA 6,73: 6,51, WR=I,04, p=0,56. Częstość 
występowania mutacji w badanej w pracy populacji zdrowych kobiet (GG 93,49%, GA 
6,51 %, AA 0%) była porównywalna z częstością obserwowaną w innych pracach badaj ących 
populacj ę europ ej ską. 


W zakresie tego polimorfizmu me zaobserwowano różnic statystycznie istotnych 
pomiędzy podgrupą kobiet z poronieniami we wczesnej fazie I trymestru oraz kontrolną 
zarówno w częstości występowania genotypów typu dzikiego GG (92,31 VS. 93,49%, 
p=0,47) jak i genotypu heterozygotycznego GA (7,69 VS. 6,51%, p=0,47). Pomimo braku 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 72 z 122
		

/p0073.djvu

			różnic statystycznie istotnych w zakresie tego polimorfizmu pomiędzy grupą kobiet z 
poronieniami pomiędzy 10 a 13 tygodniem ciąży a grupą kontrolną częściej genotyp 
heterozygotyczny występował u kobiet z poronieniami w późnym okresie pierwszego 
trymestru ciąży (dla heterozygot GA: 12,50 VS. 6,51%, p=0,31, dla allelaA: 6,25 VS. 3,25%, 
p=0,31), co jest zgodne z pracami innych autorów [Roque i wsp., 2004, Rai i wsp., 2003]. 
Przy analizie podgrupy kobiet z występowaniem poronień we wczesnym i późnym okresie I 
trymestru odnotowano występowanie tylko osób będących nosicielami genotypu typu 
dzikiego GG. Można zaobserwować w niniejszej pracy wzrost częstości występowania 
genotypów zawierających przynajmniej jeden zmutowany allel dla polimorfizmu FVL wraz 
ze wzrostem wieku ciążowego (dla kobiet z poronieniami we wczesnej fazie I trymestru 
ciąży GA - 7,69%, a dla kobiet w późnym okresie I trymestru ciąży GA - 12,5%) 
Uzyskane w pracy wyniki są porównywalne z uzyskiwanymi przez innych autorów i 
wskazują na możliwy wpływ mutacji Leiden w mechanizmie poronień nawracających w 
późnym okresie pierwszego trymestru ciąży. 


5.1.2. Polimorfizm 20210G>A genu protrombiny 


U kobiet ciężarnych polimorfizm 20210G>A ma znaczeme dla występowania kilku 
powikłań. Szacunkowe ryzyko wystąpienia poronień u matek nosicielek genotypu 
heterozygotycznego 20210G>A wynosi około 2,4 [Brenner i wsp., 1999a] i jest jeszcze 
bardziej wyraźne (około 3-krotnie) dla późnych poronień [Martinelli i wsp., 2000]. 
Kupferminc i wsp. natomiast znaleźli dwukrotnie więcej pacjentek z tą mutacją wśród kobiet 
z ciężką preeklampsją [Kupferminc i wsp., 2000; Kupferminc i wsp., 1999]. Związek 
pomiędzy mutacja 20210G>A czynnika II a występowaniem poronień nawracających nie 
jest dokładnie wyjaśniony, co może być spowodowane jego ogólnie niską częstością 
występowania w populacji ogólnej [Abbate i wsp., 2002; Goodman i wsp., 2006]. Wpływ 
polimorfizmu 20210G>A na ryzyko występowania wczesnych poronień nawracających jest 
dyskusyjny. Kutteh i wsp. nie zaobserwowali przewagi występowania PTM wśród 50 
pacjentek z wczesnymi poronieniami nawracającymi [Kutteh i wsp., 1999]. Badania Carpa i 
wsp. przeprowadzone w dwóch zróżnicowanych etnicznie grupach populacji izraelskiej, 
wykazały niższą częstość występowania mutacji 20210G>A w grupie kobiet z trzema lub 
więcej poronieniami (5/108 pacjentek - 4,6%) w stosunku do grupy kontrolnej (5/82 - 6,1%). 
W grupie badanej u 70 kobiet poronienia występowały w I trymestrze ciąży, a u pozostałych 
38 -zarówno w I jak i II trymestrze. Częściej mutacja genu protrombiny występowała w 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 73 z 122
		

/p0074.djvu

			podgrupie kobiet z poronieniami w I i II trymestrze (7,9%) w porównaniu z podgrupą, u 
których poronienia występowały tylko w I trymestrze ciąży (2,86%) [Carp i wsp., 2002]. 
Badania Pickering i wsp. (2001) także nie wskazują aby u nosicielek PTM występowały 
częściej poronienia nawracające. Badaniem objęto 122 kobiety (niejednorodna populacja 
brytyjska) z 3 lub więcej następującymi po sobie poronieniami oraz 66 kobiet z grupy 
kontrolnej. Genotyp heterozygotyczny PTM zaobserwowano u 4 pacjentek z poronieniami 
wczesnymi (3,3%) oraz u 3 z grupy kontrolnej (4,5%). Podczas analizy osób tylko rasy 
kaukaskiej wyniki nie zmieniły się znacząco 3,9% w grupie badanej (4/103) oraz 4,2% w 
grupie kontrolnej (2/48) [Pickering i wsp., 2001]. 
Natomiast badanie opublikowane przez Foka i wsp. w 2000 roku wskazuje, że polimorfizm 
20210G>A genu protrombiny ma wpływ na częstość występowania dwóch lub więcej 
poronień u kobiet z populacji greckiej. Siedem z 80 kobiet z poronieniami nawracającymi i 2 
ze 100 z grupy kontrolnej było nosicielkami PTM (9 VS. 2%, p=0,038, WR=4,7, 95%P.U: 
0,9-23). U 61 kobiet poronienia występowały tylko w I trymestrze ciąży i stwierdzono wśród 
nich 5 nosicielek mutacji (8,1%), natomiast u 19 kobiet z poronieniami w II trymestrze 
nosicielkami były 2 pacjentki (10,5%) [Foka i wsp., 2000]. 
Znaczący wpływ PTM na ryzyko występowania poronień przed 12 tygodniem ciąży 
przedstawiają badania Pihusch i wsp. (2001). U 75 pacjentek z dwoma lub więcej 
poronieniami następującymi po sobie stwierdzono częstość występowania genotypu 
heterozygotycznego 6,7% VS. 0,8% w grupie kontrolnej, WR= 8,53. Wyniku tego nie można 
wytłumaczyć tylko umiarkowanym stanem zakrzepowym powodowanym przez mutacj ę 
20210G>A stąd autorzy zaproponowali, że zwiększony poziom protrombiny może 
dodatkowo wpływać w łożysku na adhezję komórkową, proliferację mięśni gładkich i 
waskulogenezę [Pihusch i wsp., 2001]. 
Wpływ PTM na częstsze występowanie poronień przed 10 tygodniem ciąży zaobserwowali 
również Reznikoff-Etievan i wsp. (2001) w badaniu populacji francuskiej. Pośród 260 kobiet 
z grupy badanej nosicielkami mutacji było 20 kobiet (7,6%), natomiast w grupie kontrolnej 
7 z 240 pacjentek (2,9%). Współczynnik ryzyka wynosił 2,7 (95%P.U 1-7) [Reznikoff- 
Etievan i wsp., 2001]. 
W powyższej pracy stwierdzono możliwy wpływ mutacji 20210G>A genu protrombiny na 
wystepowanie poronień. Stwierdzono przewagę, pomimo braku istotności statystycznej, 
występowania genotypu heterozygotycznego GA w grupie 104 kobiet z poronieniami w 
pierwszym trymestrze ciąży 2,88 VS. 1,18% w grupie kontrolnej, przy wysokim 
współczynniku ryzyka WR=2,48 (p=0,284). Częściej wariant zawierający przynajmniej 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 74 z 122
		

/p0075.djvu

			jeden zmutowany allel wystąpił w grupie kobiet z trzema i więcej poronieniami (8,33 VS. 
1,25% w grupie kobiet z dwoma poronieniami). Jedna z pacjentek z grupy 104 kobiet z 
poronieniami w I trymestrze ciąży była nosicielką genotypów heterozygotycznych dla 
polimorfizmów 20210G>A i 1691G>A. Takiego połączenia dwóch zmutowanych 
genotypów nie znaleziono w grupie kontrolnej. W pracy Reznikoff- Etievan i wsp. (2001) aż 
5 z grupy 260 kobiet z poronieniami było nosicielkami takiego podwójnie 
heterozygotycznego genotypu, który podobnie jak w omawianej pracy nie występował w 
grupie kontrolnej (240 kobiet). W obecnie prezentowanej pracy częstość występowania 
zmutowanego allelaA polimorfizmu 20210G>A genu protrombiny (1,14% w grupie badanej 
i 0,59% w grupie kontrolnej) była porównywalna z częstością opisywaną w innych 
badaniach dotyczących populacji kaukaskich. 


Tabela 25. Częstość występowania polimorfizmu 20210G>A genu protrombiny w grupie 
badanej z poronieniami nawracaj ącymi i kontrolnej. 


izraelska 8,0 (6/76) 4,0 (4/106) NS 
brazylij ska 3,6 (2/56) 1,0 (4/384) NS 3,5 (0,6-19,7) 
amerykańska 2,0 (1/50) 2,0 (1/50) NS 
(kaukaska) 
izraelska 4/27 5/156 (3,2%) NS 5,25 (1,31-21,00) 
9 (7/80) 2,0 (2/100) 0,038 4,7 (0,9-23) 
szwedzka 3,6 (2/62) 4,3 (3/69) NS 
angielska 3,9 (4/103) 4,2 (2/48) NS 0,89 (0,16-5,05) 
(kaukaska) 
niemiecka 4,9 (5/102) 0,8 (1/128) 0,062 6,27 (0,75-52,8) 
francuska 7,6 (20/260) 2,9 (7/240) NS 2,77 (1,15-6,68) 
izraelska 5,5 (2/36) 2,0 (1/40) NS 
izraelska 4,6 (5/108) 6,1 (5/82) NS 0,75 (0,21-2,67) 
libańska 13,64 (15/110) 2,99 (2/67) 0,020 5,13 (1,14-23,20) 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 75 z 122
		

/p0076.djvu

			5.2. Polimorfizmy genu MTHFR jako czynnik występowania poronień 
nawracających 


5.2.1. Homocysteina i jej przemiany biochemiczne w organizmie 


W 1985 roku Mudd stwierdził, że kobiety z homocysteinurią, wrodzonym niedoborem 
syntazy J3-cystationinowej i znacząco podwyższonym stężeniu homocysteiny, są narażone na 
utratę ciąży prawie o 50% częściej niż zdrowe kobiety. Hiperhomocysteinemia, czyli 
obecność w surowicy krwi zbyt wysokich stężeń homocysteiny całkowitej, uważa się za 


czynnik 


ryzyka 


rozwoJu 


wielu 


chorób, 


głównie 


sercowo-naczyniowych, 


neurodegeneracyjnych, powikłań towarzyszących ciąży, wad rozwojowych płodu oraz wielu 
nowotworów. Może być ona spowodowana uwarunkowanym genetycznie spadkiem 
aktywności enzymów biorących udział w przemianach homocysteiny, niedoborami w 
żywieniu, lub niektórymi chorobami. 
Stężenie Hcy w osoczu jest najczęściej badane metodą wysokosprawnej chromatografii 
cieczowej (HPLC ang. Hżgh Performance Lżqużd Chromatography), ale może być także 
oznaczona metodami immunologicznymi. Pobrania krwi do oznaczeń homocysteiny należy 
wykonywać na czczo, ponieważ bogatobiałkowy posiłek może spowodować 15-20% wzrost 
jej stężenia [Hozyasz i wsp., 2002]. Norma fizjologiczna homocysteiny w surowicy krwi 
wynosi 5-14 /l m 0111. W tab 25 przedstawiono klasyfikację stężeń homocysteiny 
proponowaną przez badaczy niemieckich, austriackich i szwajcarskich. 


Tabela 26. Klasyfikacja stężenia homocysteiny w osoczu krwi wg DACH-LIGA 
Homocysteine. V., www . dach-li ga -homocystein. org. 
Ciężka hiperhomocysteinemi, 


Hi perhomocysteinemia 


Umiarkowana 
hi perhomocysteinemia 
stężenie tolerowane przez 
zdrowe osoby 
Stężenie bezpieczne 


U osób z ciężkimi wadami 
wrodzonymi lub homocysteinuri 
Często u homozygot z defektem 
enzymów, jak również u osób z 
ciężkimi chorobami nerek 
We wszystkich przypadkach 
wymagana interwencj a 
Leczenie u pacjentów z grup 
podwyższonego ryzyka 
Nie jest wymagane leczenie 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 76 z 122
		

/p0077.djvu

			Pomocnym w wykazaniu utajonych nieprawidłowości metabolizmu Hcy jest test obciążenia 
metioniną (O, l g/kg). Po wstępnym oznaczeniu Hcy na czczo i podaniu metioniny ponowny 
pomiar stężenia homocysteiny wykonuje się po 6 godzinach. To pozwala wykryć 
potencjalną "nietolerancję metioniny" oraz umiarkowaną hiperhomocysteinemię (HHcy). 
Dlatego ważnym jest mówiąc o HHy bardzo dokładne określenie metody użytej do jej 
oznaczenia. Test obciążeniowy metioniną wydaje się bardziej czuły do oznaczenia HHy, ale 
nie wykonuje się go u kobiet w ciąży i brakuje danych o liczbowych wartościach tego testu 
podczas ciąży [Aubard i wsp., 2000]. 
Prawidłowe stężenie homocysteiny u zdrowych, nieciężarnych kobiet w wieku rozrodczym 
wynosi pomiędzy 5,8- 12,8 /lmo1l1 [Vilaseca i wsp., 1997]. Poziom homocysteiny jest niższy 
podczas ciąży, co może być spowodowane fizjologiczną odpowiedzią na ciążę, wzrostem 
stężenia estrogenów, hemodilucją spowodowaną wzrostem objętości osocza lub wzrostem 
zapotrzebowania na metioninę zarówno przez matkę, jak i przez płód. Poziom homocysteiny 
we krwi zmniejsza się w pierwszym trymestrze ciąży, osiąga najniższą wartość w drugim 
trymestrze, a następnie delikatnie wzrasta pod koniec ciąży, aby odzyskać poziom z 
pierwszego trymestru. Dlatego też ocena umiarkowanej homocysteinemii podczas ciąży jest 
utrudniona. Dlatego pomocne w tej sytuacji mogą być badania mające na celu wykrycie u 
pacjentki mutacji w genach związanych z metabolizmem homocysteiny. 
W kilku badaniach starano się ustalić prawidłowy poziom homocysteiny podczas ciąży. 
Khong i Hague badając australijskie kobiety w 28 tygodniu ciąży stwierdzili, że poziom 
powyżej 10,9 /lmo1l1 sugeruje hiperhomocysteinemię [Khong i wsp., 1999]. 
Bonnette i wsp. ustalili, że stężenie Hcy jest o 60% niższe u kobiet po pierwszym trymestrze 
ciąży w porównaniu z kobietami nieciężarnymi niezależnie od tego ile przyjmują folianów 
[Bonnette i wsp., 1998]. Według Andersson i wsp. stężenie homocysteiny w ostatnim 
trymestrze ciąży wynosi 6, l /lmo1l1, w porównaniu z 9,5 /lmo1l1 po porodzie [Andersson i 
wsp., 1992]. Walker i wsp. wykazał, że stężenie Hcy w surowicy jest znacząco niższe 
podczas całej ciąży, a naj niższy poziom osiąga w drugim trymestrze. Znaleźli oni także 
bezpośrednią korelację pomiędzy poziomem homocysteiny i albumin, które także ulegają 
redukcji w ciąży [Walker i wsp., 1999]. Stężenie homocysteiny może także być mierzone w 
płynie owodniowym. Chociaż aminokwasy i białka w płynie owodniowym pochodzą 
głównie od matki płód. W późniejszym okresie także przyczynia się do biotransformacji 
niektórych jego składowych [Kang i wsp., 1986]. Prawidłowy rozwój płodu wymaga 
wysokiego poziomu metioniny, będącej prekursorem SAM, głównego donora grup 
metylowych w reakcjach transmetylacji związanych z biotransformacją między innymi 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 77 z 122
		

/p0078.djvu

			kwasów nukleinowych [Steegers- Theunissen i wsp., 1977, Picciano, 2000]. Jednakże 
stężenie homocysteiny w płynie owodniowym zależy od stężenia w organizmie matki i od 
sumy homocysteiny metabolizowanej i wydalonej przez płód [Kang i wsp., 1986]. 


Ryc. 10. Zmiany stężenia homocysteiny podczas ciąży [wg Walker i wsp., 1999; Aubard i 
wsp., 2000]. 


Poziom całkowitej homocysteiny w osoczu (tHcy) wzrasta wraz z wiekiem (u dzieci jest 
niższy o około 30% w porównaniu z osobami dorosłymi), jest też wyższy u mężczyzn w 
porównaniu do kobiet w tym samym wieku. U kobiet ciężarnych obserwuje się niższe 
wartości tHcy w porównaniu do kobiet nieciężarnych (ryc. 10). Wartość tHcy wzrasta 
znacznie u kobiet po menopauzie w porównaniu do kobiet w okresie premenopauzalnym. 
Może to dowodzić, że żeńskie hormony steroidowe są niegenetycznym czynnikiem 
związanym z metabolizmem homocysteiny. W niektórych badaniach udowodniono, że 
poziom homocysteiny wzrasta z 7,8 /lmol L-l w fazie lutealnej do 8,9 /lmol L-l w fazie 
folikulamej [Tallova i wsp., 1999]. Jednocześnie stwierdzono także negatywną, nieistotną 
statystycznie korelacj ę poziomu homocysteiny ze stężeniem estradiolu w obu fazach cyklu 
miesiączkowego. W przypadku kortyzolu i progesteronu nie znaleziono znaczących 
korelacji ze stężeniem osoczowej homocysteiny [Tallova i wsp., 1999]. 
Hiperhomocysteinemią (HHy) nazywamy nieprawidłowo wysokie stężenia 
homocysteiny całkowitej (tHcy), na którą składają się wszystkie rodzaje homocysteiny 
występujące w krwioobiegu. 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 78 z 122
		

/p0079.djvu

			Czynniki odpowiedzialne za powstawanie hiperhomocysteinemii można podzielić na 
genetyczne (wrodzone) i nabyte, czyli zależne od środowiska. 
a) Czynniki genetyczne: 
W genie MTHFR wykryto kilka mutacji, z których 677C>T, obecna u około 12% rasy 
białej, jest odpowiedzialna za powstawanie termolabilnej odmiany enzymu MTHFR. 
Mutacja ta jest odpowiedzialna za łagodny wzrost poziomu Hcy we krwi. 
Także nieprawidłowości w innych genach kodujących enzymy biorące udział w 
przemianach Hcy, mogą być odpowiedzialne z powstawanie RHy. W genie CBS znanych 
jest ponad 30 różnych mutacji (autosomalnych lub recesywnych). Jedną z nich jest rzadko 
występuj ąca (1/200 000 osób) mutacj a powoduj ąca klasyczną homocysteinurię (RHCu), 
opisana po raz pierwszy w 1962 roku. Choroba u osób homozygotycznych charakteryzuje 
się akumulacją Hcy we krwi oraz zwiększoną eliminacją utlenionych form Hcy z moczem. 
RHCu klinicznie objawia się opóźnieniem umysłowym, chorobami kości i oczu oraz 
przedwczesną arteriosklerozą, często prowadzącą do śmierci przed ukończeniem 30 roku 
życia. Osoby heterozygotyczne są znacznie częściej spotykane (1/70 osób) i nie występuj ą u 
nich tak drastyczne objawy choroby. Nieprawidłowości u nich można wykrywać po 
przeprowadzeniu testu obciążenia metioniną. 
b) Czynniki środowiskowe: 
Enzymy związane z metabolizmem homocysteiny do prawidłowego funkcjonowania 
wymagają obecności kofaktorów (witamin B6 i B12) oraz substratów (kwasu foliowego). 
Niedobór tych kofaktorów diecie może powodować wzrost poziomu Hcy we krwi. Ponadto 
metabolizm folianów oraz witamin B6 i Bl2 zaburzają doustne środki antykoncepcyjne 
zaWIerające estrogen i palenie papierosów. Hiperhomocysteinemię powoduje także 
występowanie różnych chorób np. nerek, wątroby, nowotwory, nadczynność tarczycy, 
łuszczyca lub alkoholizm. 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 79 z 122
		

/p0080.djvu

			2003]. 


Tabela 27. Populacje narażone na ryzyko podwyższonego poziomu Hcy [Stanger i wsp., 


. Choroba wieńcowa . Rodzinne choroby 
. Zawał mięśnia sercowo-naczymowe 
sercowego . Nadciśnienie tętnicze 
. Zmiany . Palenie tytoniu 
miażdżycowe w tętnicach. hiperlipidemia 
szyjnych . niewydolność nerek 
· Zarostowa choroba . Cukrzyca 
tętnic . Zespół metaboliczny 
. Miażdżyca tętnic 
mózgowych 
. Udar mózgu 
. Zakrzepica żylna 
. Zatorowość płucna 


. Osoby starsze 
. Wegetarianie 
. Stany zapalne przewodu 
pokarmowego 
. preeklampsja 
. Choroby nerek 
. Nadużywanie alkoholu 
. Niezrównoważona dieta 
. Ni ektóre leki 


W roku 2002 Katedra Nadciśnienia Tętniczego i Diabetologii Akademii Medycznej w 
Gdańsku we współpracy z sopocką Pracownią Badań Społecznych przeprowadziła badanie 
epidemiologiczne NATPOL PLUS, w którym uwzględniono rozpowszechnienie 
hiperhomocysteinemii w populacji dorosłych Polaków. Badanie to wykazało, że 
rozpowszechnienie hiperhomocysteinemii, definiowanej jako wartość stężenia homocysteiny 
większa niż 15 /lmo1l1, wynosi 17%. Częstość hiperhomocysteinemii była istotnie większa w 
grupie mężczyzn (23% vs. 12% u kobiet, p59 r. ż.) (Tabela 28). 


Tabela 28. Częstość występowania hiperhomocysteinemii (%) w populacji dorosłych 
Polaków [Zdrojewski i wsp., 2004]. 


57,7 33,5 6,7 
44,3 37,6 17,4 
razem 51, l 35,5 12 
48,1 41,7 9,71 
29,3 47,7 23 
razem 38,7 44,7 16,4 
28,3 46,4 25,3 
16,2 49,4 34,4 
razem 23,3 47,7 29 
K- kobiety, M- mężczyźni 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 80 z 122
		

/p0081.djvu

			Hiperhomocysteinemię często obserwuje SIę u pacjentów z chorobą wieńcową 
zaawansowaną miażdżycą oraz z zakrzepicą. Wysokie wartości homocysteiny prowadzą do 
uszkodzenia komórek śródbłonka, zwiększenia ekspresji czynnika tkankowego, wzmożenia 
oksydacji LDL, zwiększenia aktywności czynnika V oraz do upośledzenia fibrynolizy. 


5.2.2. Polimorfizmy genu MTHFR 


Opisywane są znaczne etniczne różnie we frekwencji występowania polimorfizmów 
genu MTHFR. Jednak frekwencje alleli dla wariantów innych niż 677C >T nie są 
precyzyjne, bowiem badania przeprowadzone były w małych, często niejednolitych 
populacjach. Częstość występowania all el ei najczęściej badanych polimorfizmów genu 
MTHFR w różnych populacjach przedstawia tab. 28. 
Tabela 29. Częstość występowania alleli wybranych polimorfizmów genu MTHFR w 
różnych populacjach [wg Brockton i wsp., 2006]. 


Frost i wsp. 
1995 


A222V 


Europejczycy: 20-53 
Afrykańczycy: 0-10 
Azj aci: 26-44 
Europejczycy: 28-36 
Hiszpanie: 18 
Afrykańczycy: 9-22 
Japończycy: 21 
Europejczycy: 0-4 
Afro-Amerykanie: 39 
Brazylijczycy "czarni": 32 
Rasa kaukaska: 6,9 
Hiszpanie: 5,8 
Afro-Amerykanie: 3, l 


E429A 


brak zmiany 


R594Q 


5.2.2.1. Polimorfizm 677C>T genu MTHFR 


Frekwencja allela 677T jest największa (>40%) w populacji hiszpańskiej, włoskiej i 
meksykańskiej, a naj niższa u mieszkańców Mryki Subsaharyjskiej «10%). Różnice w 
częstości występowania zmutowanego allela T można zaobserwować również w populacji 
europejskiej, w krajach Północnej Europy występuje on u 6-10% populacji, a w okolicach 
Śródziemnomorskich u 13-18%. 
W wielu krajach wzbogaca się żywność kwasem foliowym lub zaleca się suplementację, 
głównie kobietom planującym ciążę lub będących w ciąży. Munoz-Moran i wsp. w grupie 
695 osób zamieszkujących południowe regiony Hiszpanii wykazali znaczną różnicę w 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 81 z 122
		

/p0082.djvu

			występowaniu zmutowanego allela T wśród różnych grup wiekowych, zwłaszcza duży 
wzrost częstości występowania genotypu TT zaobserwowali oni u ludzi poniżej 20 roku 
życia. Prawdopodobnie jest to związane ze wzrostem rozpoczętej w latach 80-tych XX 
wieku suplementacji kwasu foliowego wśród kobiet ciężarnych. Sugerują oni także, że 
różnica w występowaniu zmutowanego allela pomiędzy Europą Północną a Południową 
może być związana z dietą śródziemnomorską [Munoz-Moran i wsp., 1998]. 
Pomimo pozytywnego z jednej strony, wpływu tych działań zwiększenie w przyszłości 
procentu nosicieli zmutowanego genotypu TT może prowadzi do częstszych zachorowań na 
choroby sercowo- naczyniowe i większe ryzyko występowania wielu nowotworów w 
populacji (ryc. 11) [Lucock i Yates, 2005; Munoz-Moran i wsp., 1998]. 


Biosynteza metioniny 


syntaza 
metioninowa 


etionina 


homocysteina 


5-M etylotetrahydro- 
-ff an 


D przesunięcie równowagi 
dające pierszeństwo 
allelowi 677C 
przepływ jednostek 

 jednowęglOWYCh 
przesunięcie równowagi 
dające pierszeństwo 
allelowi 677T 


5,1 O-m etylenotetrahydrofolian 


syntaza 
tym idylanowa 


dUMP 


TMP 


biosynteza nukleotydów 
i wbudowywanie do D NA 


Ryc. 11. Model mechanizmu genetycznej selekcji oparty na wzajemnej interakcji pomiędzy 
folianami i wariantem polimorficznym 677C> T genu MTHFR [Lucock i Yates, 2005]. 


Zgodnie z tym modelem równowaga pomiędzy zużywaniem 5,10-metylenotetrahydrofolianu 
do syntezy DNA lub metioniny zależy od występowania allela C lub T polimorfizmu 
677C> T i stężenia folinów. W przypadku występowania wariantu 677T genu MTHFR i przy 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 82 z 122
		

/p0083.djvu

			dostatecznej podaży folianów jednostki jednowęglowe są głównie zużywane do syntezy 
DNA, a nie metioniny. Obecność allela 677Tw sytuacji deficytu kwasu foliowego powoduje 
akumulację uracylu i jego błędne wbudowywanie na miejsce tyminy. To w konsekwencji 
prowadzi do zaburzeń sekwencji kodu genetycznego i łamliwości chromosomów. 
W 1993 roku Wouters wsp. jako pIerwsI opisali związek pomiędzy 
hiperhomocysteinemią i poronieniami, znajdując podwyższony poziom homocysteiny u 14% 
pierwiastek i u 33% wieloródek z wczesnymi poronieniami. Badacze ci zasugerowali 
uszkodzenie naczyń kosmówki spowodowane podwyższonym poziomem homocysteiny 
powodującym poronienia lub niemożność implantacji. Również związek pomiędzy 
hiperhomocysteinemią a poronieniami nawracającymi zaobserwowali Nelen i wsp. oraz 
Brenner i wsp., którzy opisail silny związek pomiędzy nosicielami genotypu 
homozygotycznego 677TT MTHFR i poronieniami nawracającymi [Brenner i wsp., 1999a, 
Nelen i wsp., 1997]. Możliwym wytłumaczeniem dla tego wyniku może być fakt, ze 
podczas początkowego okresu ciąży duże ilości homocysteiny zostają przekształcane przez 
MTHFR do metioniny. Jeśli w genie MTHFR występuje mutacja ta transformacja zostaje 
niedostatecznie przeprowadzona i powoduje to wzrost poziomu homocysteiny w płynie 
owodniowym, co w następstwie może powodować poronienia nawracające [Steegers- 
Theunissen, 1997]. Związek pomiędzy termolabilnym wariantem MTHFR i poronieniami 
nawracającymi lub utratami ciąży opisywali również autorzy sześciu badań (599 pacjentek i 
498 osób z grupy kontrolnej), zestawieni w metaanalizie przez Nelen i wsp. (2000), który 
wykazał współczynnik ryzyka WR=I,40 (95%P.U 1,0-2,0) dla genotypu TT vs. kombinacji 
genotypów CT i Cc. Holmes i wsp. nie zaobserwowali wpływu wariantu 677T genu 
MTHFR na częstość występowania poronień nawracających w populacji angielskiej 
[Holmes i wsp., 1999]. 
Nelen i wsp. (1997) przebadali 185 kobiet rasy białej, mieszkanek Holandii, u których 
wystapiły w tym samym zwiążku partnerskim co najmniej dwa poronienia samoistne przed 
17 tygodniem ciąży. Grupę kontrolną (113 kobiet) dopasowano wiekowo i ekonomicznie 
oraz nie występowały u nich poronienia i inne komplikacje ciąży. Uzyskali znaczącą 
przewagę wy step owani a genotypu zawierającego dwa zmutowane allele (T1) wśród kobiet z 
poronieniami - 16% w porówanianu z grupą kontrolną - 5% (WR=3,3; 95%P.U=I,3-10,1) 
[Nelen i wsp., 1997]. 
Quere i wsp. (1998) w populacji francuskiej badając 100 kobiet z wczesnymi, co najmniej 
trzema poronieniami o nieznanej przyczynie i 100 kobiet z grupy kontrolnej uzyskała 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 83 z 122
		

/p0084.djvu

			przewagę nie znaczącą statystycznie: 28 VS. 32% dla genotypu CC i 20 VS. 14% dla genotypu 
TT [Quere i wsp., 1998]. 
W badaniu austriackim Hohlagschwandtner i wsp. (2003) 145 kobiet z trzema lub więcej 
poronieniami poniżej 20 tygodnia ciąży i 101 kobiet bez poronień w wywiadzie uzyskał 
częstość występowania zmutowanego allela T u 32,4% kobiet z poronieniami i 27,2% w 
grupie kontrolnej, a allela C odpowiednio 67,6% i 72,8%. W przedstawianej pracy uzyskano 
bardzo zbliżone częstości występowania alleli (T 34, 13 VS. 27,51 % w grupie kontrolnej oraz 
C 65,87 VS. 72,49% w grupie kontrolnej). 
Metaanaliza Ren i Wang obejmująca 26 badań z 15 państw (pięć z Chin, po trzy z Izraela i 
Niemiec, po dwa z Austrii, Japonii i Stanów Zjednoczonych i po jednym z innych państw) 
łącznie zawierających 2120 niewytłumaczonych przypadków poronień nawracających i 
2949 osób włączonych do grupy kontrolnej, wykazała dla genotypów TT VS. CC WR=I,49 
(95%P.U, 1,12-2,00), TT vs. kombinacja genotypów CT i CC WR=I,40 (95%P.U, 1,11- 
1,77). Stwierdzili oni, że mutacja 677C>T genu MTHFR nie jest czynnikiem ryzyka 
wystąpienia poronień nawracających (z wyjątkiem populacji chińskiej) [Ren, Wang, 2006]. 
Również w obecnie przedstawianej pracy nie uzyskano w zakresie polimorfizmu 
677C>T żadnych różnic istotnych statystycznie. Zaobserwowano jedynie niewielką 
przewagę w grupie kobiet z poronieniami w porównaniu z grupą kontrolną genotypów TT 
(10,58 vs. 7,69%; p=0,27) i CT(47,11 vs. 39,64%; p=0,14) 


Tabela 30. Częstość występowania polimorfizmu 677C> T genu MTHFR w grupie kobiet z 
poronieniami nawracającymi i kontrolnej w badanych populacjach. 


29/185 6/113 3,3 (1,3-8,3) 
20/1 00 14/1 00 1,5 (0,7-3,2) 
<17 17/94 28/150 1,0 (0,5-1,9) 
::;12 11/129 6/67 0,9 (0,3-2,7) 
I trymestr 4/50 2/50 2, l (0,4-11,9) 
::;16 4/41 4/18 0,4 (0,1-1,7) 
<20 21/145 7/101 2,27 (0,9-5,6) 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 84 z 122
		

/p0085.djvu

			5.2.2.2. Polimorfizm 1298A>C genu MTHFR 


Polimorfizm 1298A>C genu MTHFR jest znacznie rzadziej opisywany niż polimorfizm 
677C>T i może dlatego wpływ tej substytucji na aktywność enzymu MTHFR nie jest 
dokładnie wyjaśniony. Weisberg i wsp. (1998, 2001) donoszą o obniżonej aktywności 
enzymu u osób będących nosicielami obydwu polimorfizmów 677C> T i 1298A>C. Autorzy 
ci w pracy z roku 2001 stwierdzają, że homozygoty 677TT, homozygoty 1298CC i złożone 
genotypy heterozygotyczne obu tych polimorfizmów powodują obniżenie aktywności 
enzymu MTHFR żn vżtro odpowiednio do 45%,68% i 41% [Weisberg i wsp., 2001]. Chango 
i wsp. (2000) także wykazalił, że obecność mutacji 1298A>C obniża aktywność MTHFR i 
złożone genotypy heterozygotyczne dla obu polimorfizmów wykazuj ą aktywność podobną 
do wariantu homozygotycznego zmutowanego 677TT. 
Wiele badań w ostatnich latach nie wykazuje funkcjonalnego efektu samego polimorfizmu 
1298A>C. W opini niektórych badaczy wariant 1298A>C w odróżnieniu od polimorfizmu 
677C>T nie powoduje ani termolabilności białka ani wzrostu stężenia tHcy w osoczu 
[Hanson i wsp., 2001; Friso i wsp., 2002]. Friedman i wsp. (1999) zaobserwował niższy 
poziom tHcy u pacjentów homozygot 1298CC natomiast nie obserwował znaczących różnic 
dla złożonych heterozygot. Crott i wsp. (2001) donosi o wzroście inkorporacji żn vżtro 
uracylu u heterozygot 1298AC przy niskim stężeniu kwasu foliowego, jednak w pracy 
brakuje badań dotyczących komórek pacjentów z genotypem homozygotycznym. 
Yamada i wsp. (2001) sugerują, że interakcje allosteryczne pomiędzy domenami 
katalityczną i regulatorową sąsiadujących podjednostek mogą zmieniać wiązanie kofaktora 
FAD, opiera to na obserwacji że złożone genotypy heterozygotyczne (CTIAC) nie różnią się 
aktywnością od genotypu TT. Kilku autorów sugeruje, że nosicielstwo zmutowanych 
homozygotycznych genotypów obu wariantów 677C> T i 1298A>C może powodować 
fenotyp letalny [Le Marchand i wsp., 2002, Isotalo i wsp., 2000, Zetterberg i wsp., 2002]. 
W pracy tunezyjskich badaczy [Mtiraui i wsp., 2006] badano 200 pacjentek z trzema lub 
więcej poronieniami oraz utratami ciąży, które wystąpiły pomiędzy 5 i 30 tygodniem ciąży, 
oraz 200 kobiet dobieranych wiekowo i etnicznie do grupy badanej (case - control study), u 
których nigdy nie występowały poronienia oraz inne komplikacje ciąży. Zbadali oni w obu 
grupach polimorfizmy 677C>T i 1298A>C genu MTHFR i zaobserwowali przewagę obu 
zmutowanych wariantów w grupie kobiet z poronieniami w porównaniu do grupy kontrolnej 
(genotyp 677TT 30% vs. 7% w grupie kontrolnej oraz 1298CC 13,5% vs. 4% w grupie 
kontrolnej). 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 85 z 122
		

/p0086.djvu

			W pracy Mtiraui i wsp. (2006) podzielono grupę badaną na trzy podgrupy ze względu na 
czas występowania utraty ciąży: poronienia (5-12 tydzień ciąży), późne poronienia i utraty 
ciąży (13-30 tydzień ciąży) oraz grupę łączoną. Ryzyko występowania poronień po tym 
podziale było znacząco wyższe tylko u nosicielek wariantów homozygotycznych 
zmutowanych obu badanych polimorfizmów (677TT i 1298CC) i wystąpiło tylko u 
pacjentek, które doświadczyły późnych (677T1) i łączonych wczesnych i późnych (677TT i 
1298CC), lecz nie zaobserwowano żadnego wpływu tych wariantów na poronienia wczesne. 
W populacji, którą badano w przedstawianej pracy nie uzyskano tak znaczącej przewagi w 
zakresie polimorfizmu 1298A>C (1298CC 12,5% w grupie 104 kobiet z poronieniami i 
10,6% w grupie kontrolnej). Jednak obecna praca dotyczy wyłącznie kobiet z poronieniami 
w pierwszym trymestrze ciąży (6- 13 tydzień ciąży). 
Niektórzy autorzy sugerują, że polimorfizm 1298A>C nie wykazuje istotnego związku z 
poronieniami nawracającymi gdy jest analizowany osobno lecz wskazują na znaczącą 
korelację gdy jest on badany wraz z innymi polimorfizmami związanymi z występowaniem 
trombofilii wrodzonej [Goodman i wsp., 2006; Subrt i wsp., 2008]. W omawianej pracy 
również nie zaobserwowano żadnych różnic istotnych statystycznie badając sam 
polimorfizm 1298A>C genu MTHFR. Jednak analizując współwystępowanie tego wariantu 
z innymi badanymi w genie MTHFR stwierdzono znaczną, statystycznie istotną przewagę 
współwystępowania łączonych genotypów heterozygotycznych CT/AC (677/1298 MTHFR) 
28,85% w grupie kobiet z poronieniami vs. 15,98% w grupie kontrolnej (WR=2,33; 
95%PU=I,03-5,34; p=0,02) oraz AC/GA (1298/1793 MTHFR) odpowiednio 12,50 vs. 3,55% 
(WR=3,87; 95%PU=I,24-13,35; p=0,008). 
Również w pracy Mtiraui i wsp. dotyczącej populacji kobiet tunezyjskich zaobserwowano 
różnicę współwystępowania genotypów CT/AC (14,3 vs. 9,2%; WR=2,73; 95%PU=0,92- 
7,19; p=O,IO). Co interesujące, w pracy tej u żadnej pacjentki nie występował genotyp 
zawierający oba dzikie allele (CC/AA), który w naszych grupach występował u 9,61% kobiet 
z poronieniami i u 14,79% kobiet z grupy kontrolnej. Natomiast zaobserwowali oni 
genotypy zawierające trzy zmutowane allele TT/AC (25,5 vs. 6,9% w grupie kontrolnej) i 
CT/CC (13,3 vs. 2,3% w grupie kontrolnej), które nie wystąpiły w naszym badaniu. Genotyp 
zawierający cztery zmutowane allele (TT/CC) nie został zaobserwowany ani w populacji 
tunezyjskiej ani w obecnej pracy dotyczącej populacji kobiet polskich. 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 86 z 122
		

/p0087.djvu

			5.2.2.3. Polimorfizm 1793G>A genu MTHFR 


W ostatnich latach opublikowano wiele prac, które z różnymi wynikami ukazują wpływ 
polimorfizmów 677C>T i 1298A>C na częstość występowania poronień nawracających. W 
prezentowanej pracy badano również polimorfizm 1793G>A i jego związek z dwoma i 
więcej poronieniami nawracającymi w pierwszym trymestrze ciąży. Jest to pierwsza praca 
badająca ten polimorfizm w grupie kobiet z poronieniami nawracającymi. Rady i wsp. 
(2002) badali częstość występowania polimorfizmu 1793G>A pośród różnych grup 
etnicznych i stwierdzili, ze zmutowany wariant alleliczny 1793A najczęściej występuje 
wśród rasy kaukaskiej (6,9%), z czego w populacji hiszpańskiej (5,8%),w populacji afro - 
amerykańskiej (3,1%) i naj rzadziej u żydów aszkenazyjskich (1,3%). Częste występowanie 
zmutowanego allela A opisano w populacjach azjatyckich. W populacji Indonezyjskiej, ze 
wschodniej Jawy częstość występowania allelaA wynosiła 26,6% [Sadewa i wsp., 2004]. 
W pracy chińskich autorów [Mao i wsp., 2008] w 13 populacjach łącznie analizujących 923 
osoby stwierdzono występowanie 6 nosicieli genotypu M (częstość występowania allela A 
9,26%). 
W pracy Doroszewskiej I wsp. (2007) badającej populację polską stwierdzono natomiast 
małą częstość występowania allela A (2,5%) w grupie kontrolnej 50 osób (34 kobiety i 16 
mężczyzn). W pracy tej stwierdzono występowanie 95% genotypu GG, 5% GA i 0% 
zmutowanego genotypu AA [Dorszewska i wsp., 2007]. Podobne wyniki rozkładu 
genotypów uzyskano w grupie kontrolnej obecnym badaniu (95,86% GG, 4,14% GA i 0% 
AA). 
W innych pracach dotyczących różnych populacji również nie obserwowano występowania 
zmutowanego homozygotycznego genotypu 1793AA. U żadnej z 795 osób populacji 
kaukaskiej i afro-amerykańskaiej z chorobą niedokrwienną serca nie stwierdzono 
wystepowania genotypu 1793M [Kebert i wsp., 2006]. Również w populacjach 
brazylijskich 76 pacjentów z przewlekłą niewydolnością nerek i podwyższonym stężeniem 
homocysteiny [Domenici i wsp., 2007] oraz 83 pacjentów chorych na cukrzycę nie 
stwierdzono obecności genotypu M [Melo i wsp., 2006]. Obserwacje te są zgodne z 
wynikami prezentowanymi w obecnie omawianej pracy gdzie nie zaobserwowano genotypu 
zawierającego dwa zmutowane allele (1793AA) zarówno wśród kobiet z poronieniami, jak i 
w grupie kontrolnej. 
W prezentowanej pracy w grupIe 104 kobiet z poronieniami rozkład genotypów 
polimorfizmu 1793G>A prezentował się następująco: GG 84,62%, GA 15,38% oraz M 0%. 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 87 z 122
		

/p0088.djvu

			Zaobserwowano istotne statystycznie różnice w częstości występowania genotypu GA 15,36 
vs. 4,14% w grupie kontrolnej oraz allelaA 7,69 vs. 2,07%. 
Interesującym jest fakt, że prawdopodobnie mutacja 1793G>A może wpływać na stężenie 
homocysteiny w osoczu. W grupie 86 pacjentów chorujących na cukrzycę typu 2 
stwierdzono podwyższone stężenie homocysteiny u 76 osób (stężenie homocysteiny 26, l ::I: 
14,2/lmol/L) oraz prawidłowe stężenie homocysteiny u 13 osób (10,20 ::I: 2,44/lmol/L). 
Obecność heterozygotycznego genotypu GA stwierdzono u 5 osób z 76 z podwyższonym 
poziomem Hcy oraz tylko u l z 13 osób, u których odnotowano prawidłowe stężenie Hcy 
[Melo i wsp., 2006].W przeciwieństwie do tego w badaniu osób po przeszczepie nerki 
Winkelmayer i wsp. (2005) sugerują, że polimorfizm 1793G>A może raczej wykazywać 
stabilizacyjny niż destabilizacyjny efekt na aktywność MTHFR [Winkelmayer i wsp., 2005]. 
Sugeruje się również możliwy wpływ polimorfizmu 1793G>A na ryzyko występowania raka 
endometrium [Xu i wsp., 2007] raka płaskonabłonkowego głowy i szyi [Neum ann i wsp., 
2005], choroby Alzhaimera i Parkinsona [Dorszewska i wsp., 2007] natomiast polimorfizm 
ten okazał się nieistotny w etiologii raka płuc [Shi i wsp., 2005]. Badania obecności 
zmutowanego wariantu tego polimorfizmu w różnych populacjach, rozwOJU 
hiperhomocysteinemii i jego znaczenia klinicznego pozwolą lepiej poznać i leczyć liczne 
choroby związane z metabolizmem folianów. 
W pracy Mao i wsp. gdzie przeprowadzono analizę nierównowagi sprzężeń (LD ang. 
lżnkage dżsequżlżbrżum) stwierdzono, że wariant 1793G>A był w nierównowadze sprzężeń z 
polimorfizmami genu MTHFR 677C>T i 1298A>C w populacji chińskiej [Mao i wsp., 
2008]. Autorzy ci wnioskują, że istotnym jest badanie tych trzech polimorfizmów 
równocześnie i oszacowanie możliwych interakcji gen-gen oraz gen-wpływ czynników 
środowiskowych, a w szczególności odżywiania (foliany) na rozwój choroby [Mao i wsp., 
2008]. Również nierównowagę sprzężeń tych trzech polimorfizmów potwierdzono w 
populacji amerykańskiej (białej nie-hiszpańskiej, mieszkańcy Teksasu) [Shi i wsp.,2005]. 


5.3. Inne przyczyny trombofilii wrodzonej wpływające na występowanie 
u tra ty ciąży 


Mutacje czynnika V Leiden, protrombiny 20210G>A oraz genu MTHFR należą do 
najczęściej występujących trombofilii wrodzonych. Niedobory antytrombiny III oraz białek 
C i S występują rzadziej (poniżej 1% populacji ogólnej) i w związku z tym ich znaczenie w 
powikłaniach położniczych może wydawać się mniejsze. Jednak Rekomendacje Polskiego 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 88 z 122
		

/p0089.djvu

			Towarzystwa Ginekologicznego z 2008 roku zalecają wykonanie badań stężenia AT III oraz 
białek C i S u wszystkich kobiet z powtarzającymi się poronieniami [Rekomendacje PTG 
2005 i 2008]. 


5.3.1. Niedobór anty trombiny III 


Antytrombina III (AT III) jest endogennym inhibitorem proteaz serynowych (serpin ang. 
serżne protease żnhżbżtor), trombiny i czynnika Xa, w mniejszym stopniu czynników IXa, 
XIa, XIIa, tPA, urokinazy, trypsyny, plazminy i kalikreiny. Jest 58kDa jednołańcuchową 
glikoproteiną syntetyzowaną przede wszystkim w hepatocytach wątroby, w niewielkich 
ilościach również przez śródbłonek i makrofagi. Inaktywacja czynników osoczowych polega 
na utworzeniu wiązania estrowego między odsłoniętą grupą karboksylową AT III, a grupą 
hydroksylową reszty serynowej aktywnego centrum proteaz. Powstałe tą drogą 
nieodwracalne kompleksy stechiometryczne (l: l), szybko następnie są usuwane z krążenia 
przez komórki układu siateczkowo-śródbłonkowego wątroby. Reakcja tworzenia 
kompleksów jest wielokrotnie przyspieszana przez przyłączenie heparyny (kofaktor 
egzogenny) lub siarczanu heparanu (kofaktor endogenny). 
Związek pomiędzy niedoborem AT III, a zakrzepicą odkrył w 1965 roku Edberg. Wrodzony 
niedobór AT III występuje z częstością 1/2000 -1/5000 przypadków w populacji ogólnej. 
Może mieć charakter ilościowy lub jakościowy. Dziedziczy się w sposób autosomalny 
dominujący. Gen kodujący AT III zlokalizowany jest na chromosomie Iq23-25 i zawiera 
siedem eksonów. Pierwszą mutację łączącą się z niedoborem AT III opisał Prochownik i 
wsp. w 1983 roku [Prochownik i wsp., 1983]. 
Istnieje ogólnie zaakceptowana, uniwersalna nomenklatura dla różnych typów niedoborów 
antytrombiny III [Lane i wsp., 1997]. Typ I klasyczny niedobór antytrombiny III jest wadą 
wrodzoną autosomainą, dominującą. Osoby heterozygotyczne mają 
50% z prawidłowego 
poziomu osczowego zarówno aktywności jak i antygenu antytrombiny [van Boven i Lane, 
1997]. Całkowita nieobecność antytrombiny nie została dotychczas opisana i może być 
letalna żn utero. Niedobór typu I spowodowany jest obecnością około 80 mutacji 
punktowych i 12 dużych delecji [Lane i wsp., 1997]. Typ II pacjenci, którzy mają niski 
poziom aktywności antytrombiny ale prawie prawidłowy antygen antytrombiny posiadają 
typ II niedoboru antytrombiny. Występowanie różnych wariantów inhibitora z osłabioną 
aktywnością dostarczył istotnych danych dla zrozumienia mechanizmu działania 
antytrombiny. Zidentyfikowano około 35 różnych form i pogrupowano je w kilka kategorii 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 89 z 122
		

/p0090.djvu

			[Lane i wsp., 1997]. Chociaż przy obecności mutacji typu II może nastąpić osłabienie 
wewnątrzkomórkowej obróbki i wydzielania antytrombiny, ogólnie antytrombina III jest 
syntetyzowanajest w normalnej ilości i ma normalny czas półtrwania w krążeniu. 


Mniej sze znaczeme mutacji antytrombiny III w rozwoJu powikłań zakrzepowych w 
czasie ciąży może wynikać z ich stosunkowo rzadkiej częstości występowania w populacji 
ogólnej. W badaniu przeprowadzonym przez Prestona i wsp. (1996) w grupie 843 kobiet 
zauważono wzrost ryzyka wystąpienia zgonów wewnątrzmacicznych w związku z 
występowaniem niedoboru antytrombiny III (WR 5,2; 95% PU 1,5-18,1) i marginalny 
wzrost ryzyka wystąpienia poronień (WR 1,7; 95% PU 1,0-2,8) [Preston i wsp., 1996]. Gris i 
wsp. nie wykazali niedoboru antytrombiny III pośród 232 kobiet, u których wystąpił co 
najmniej jeden zgon wewnątrzmaciczny [Gris i wsp., 1999]. 


5.3.2. Wrodzone niedobory białek C i S 


Białko C jest głównym fizjologicznie występującym antykoagulantem, protezą serynową 
zależną od witaminy K. W osoczu występuje jako forma nieaktywna (zymogen proteazy 
serynowej). W formę aktywną przechodzi pod wpływem kompleksu trombina- 
trombomodulina, przy udziale białka S. Po aktywacji nabywa zdolności 
przeciwzakrzepowych poprzez inaktywację czynników Va i VIIIa. Działa również 
profibrynolitycznie poprzez degradację PAI-I (inhibitora tkankowego aktywatora 
plazminogenu). Niedobór białka C został po raz pierwszy opisany przez Gryfina w 1981 
roku, występuje w populacji ogólnej z częstością 1/16000 - 1/36000. Gen kodujący białko C 
znajduje się na krótkim ramieniu chromosomu 2 (2p13-14) [Patracchini i wsp., 1989]. 
Występują dwa typy niedoboru I - ilościowy i funkcjonalny, oraz II - o upośledzonej funkcji. 
Niedobór białka C jest chorobą dziedziczoną autosomalnie dominująco (postać 
heterozygotyczna manifestuje się klinicznie zakrzepicą) lub autosomalnie recesywnie 
(postać heterozygotyczna klinicznie bezobjawowa, homozygotyczna manifestuje się 
klinicznie plamicą piorunującą w okresie noworodkowym, a białko C jest niewykrywalne w 
surowicy). Białko C posiada swoje naturalne inhibitory PCI oraz al-antytrypsynę 
Białko S jest glikoproteiną syntetyzowaną w wątrobie przy udziale witaminy K. Jest ono 
kofaktorem białka C w reakcji degradacji czynników Va i VIIla. W osoczu występuje w 
dwóch postaciach: wolnej (35-40%), oraz związanej z białkiem wiążącym składową C4b 
dopełniacza (C4bBP 60-65%). Tylko postać wolna jest aktywna C4bBP należy do białek 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 90 z 122
		

/p0091.djvu

			fazy ostrej, w stanach zapalnych wzrasta jego ilość, co powoduje spadek ilości wolnego 
białka S. 


Niedobór białka S po raz pierwszy opisany przez Compa i wsp. oraz przez Schwarz i wsp.w 
1984 roku. Jest dziedziczony autosomalnie dominująco i istnieją dwa typy wrodzonego 
niedoboru: typ I (białko S występuje prawie wyłącznie w postaci związanej z C4bBP, a 
poziom wolnego białka jest niski) oraz typ II (obniżony poziom białka wolnego 
związanego). 
Wyniki badań EPCOT wskazują na niewielki wzrost ryzyka wystąpienia zgonu 
wewnątrzmacicznego wśród kobiet z niedoborem białka C (1,2 VS. 0,6% WR 2,3; 95% PU 
0,6-8,3) i niedoborem białka S (1,9 VS. 0,6% WR 3,3; 95% PU 1,0-11,3). W badaniu tym nie 
uzyskano znaczących różnic dla ryzyka wystąpienia poronień w porównaniu z grupą 
kontrolną (odpowiednio 15,8 VS. 11,6% i 14,6 VS. 11,6%) [Preston i wsp., 1996]. 


5.4. Polimorfizmy innych genów włączonych w kaskadę krzepnięcia i ich 
związek z występowaniem poronień 


Fibrynogen jest prekursorem fibryny, która jest podstawowym składnikiem skrzepu. 
Cząsteczka fibrynogenu składa się z trzech łańcuchów: alfa (FGA),beta (FGB), gama 
(FGG), każdy kodowany przez osobny gen. Wysoki poziom fibrynogenu we krwi powoduje 
wzrost ryzyka wystąpienia zakrzepicy żylnej głównie u młodych ludzi. Najczęściej badanym 
polimorfizmem jest substytucja G>A w pozycji nukleotydowej -455 genu FGB. Ten wariant 
genetyczny jest związany z łagodnym wzrostem stężenia fibrynogenu lecz wydaje się nie 
powodować wzrostu ryzyka wystąpienia zakrzepicy żylnej [Austin i wsp., 2000; Koster i 
wsp., 1994]. Inny, rzadziej badany polimorfizm związany jest z ryzykiem wystąpienia 
zatorowości płucnej i występuje w genie FGA, w pozycji 4266 A>G (Thr312Ala). 
Przypuszcza się, że zmienia on uSIeclOwanie fibryny [Carter i wsp., 2000]. Genotyp 
Ala312Ala prowadzi do zmniejszenia siły krzepnięcia i wyższego ryzyka embolizacji (tabela 
31). Ko i wsp. (2006) znaleźli haplotyp genu FGA zawierający wariant Thr312Ala związany 
zarówno z zatorowością płucną i wystąpieniem choroby zakrzepowej w populacji 
tajwańskiej [Ko i wsp., 2006]. 
Poza opisywanym w obecnej pracy polimorfizmem 20210G>A genu protrombiny, 
wpływ na rozwój zakrzepicy żylnej może mieć wariant protrombiny 19911A>G, również 
powodujący nieznacznie wyższy poziom protrombiny [Ceelie i wsp., 2001; Martinelli i 
wsp., 2006; Chinthammitr i wsp., 2006]. Początkowo badacze sugerowali, że polimorfizm 
19911A>G zmienia ryzyko występowania zakrzepicy u nosicieli wariantu 20210G>A 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 91 z 122
		

/p0092.djvu

			[Ceelie i wsp., 2001, Perez- Ceballos i wsp., 2002], jednak ostatnio dwa duże badania 
opisały wzrost ryzyka wystąpienia zakrzepicy u nosicieli mutacji 19911A>G niezależnie od 
innych genetycznych czynników ryzyka [Martinelli i wsp., 2006; Chinthammitr i wsp., 
2006,]. 
W genie czynnika V poza mutacją Leiden, niektórzy autorzy znaczenie w rozwoju 
zakrzepicy przypisują częstemu haplotypowi, zawierającemu kilka polimorfizmów w genie 
czynnika V. Ten haplotyp - FV HR2 opisany po raz pierwszy przez Lunghi i wsp. [Lunghi i 
wsp., 1996] jest związany ze zmniejszeniem aktywności kofaktora w inaktywacji FVIII i 
powstaniem bardziej prozakrzepowej izoformy FV. Wariantem odpowiedzialnym za 
fenotyp FV HR2 jest prawdopodobnie polimorfizm 6755A>G (Asp2194Gly) [Vos i wsp., 
2006]. Jednak wpływ haplotypu FV HR2 na rozwój zakrzepicy nie jest dobrze 
udokumentowany. Badania indywidualne przedstawiają sprzeczne wyniki, natomiast w 
metaanalizie Castaman i wsp. (2003) przedstawiono zsumowany z ośmiu prac współczynnik 
ryzyka wystąpienia VTE związanego z haplotypem HR2, który nie był statystycznie 
znaczący i wynosił on 1,15 (95% P.U 0,98-1,36). 
W przypadku czynnika VIII badano miej sca przeCIęCIa, regIOny promotorowy 
poliadenylacji genu FVIII lecz nie znaleziono mutacji odpowiadającej za wzrost stężenia 
FVIII i wystąpienie zakrzepicy [Kamphuisen i wsp., 2001; Mansvelt i wsp., 1998; Roelse i 
wsp., 1996]. W dwóch badaniach stwierdzono niższe stężenie FVIII związane z 
polimorfizmem 94901C>G (Asp1241Glu), który prawdopodobnie chroni przed zakrzepicą 
żylną [Bezemer i wsp., 2007; Scanavini i wsp., 2005]. W badaniu haplotypów zawierających 
wariant 1241Glu (HTI, HT3, HT5), został potwierdzony niższy poziom FVIII lecz wydaje 
się on ograniczać do męskich nosicieli haplotypu HTI [Nossent i wsp., 2006]. 
Czynnik XII (F XII) jest związany zarówno ze szlakiem wewnątrzpochodnym 
krzepnięcia, jak i fibrynolizy. Chociaż sugeruje się, że niedobór FXII może powodować 
wzrost ryzyka wystąpienia zakrzepicy, nadal mało badań potwierdza ten związek. W 1998 r. 
Kanaji i wsp. [Kanaji i wsp., 1998] opisali polimorfizm FXII 46C>T, który jest związany ze 
zmniejszonym poziomem FXII w osoczu. W badaniu opartym na analizie danych 
sprzężonych Tirado i wsp. uzyskali współczynnik ryzyka 4,8 (95% P.U, 1,5-15,6) dla 
genotypu TT [Tirado i wsp., 2004]. Jednak inne badania nie potwierdziły tego odkrycia 
[Grunbacher i wsp., 2005; Bertina i wsp., 2005; Franco i wsp.,1999]. 
Czynnik XIII (F XIII) stabilizuje skrzep fibrynowy poprzez usieciowywanie monomerów 
fibryny. Wariantem genetycznym, który wpływa na stabilizację skrzepu jest polimorfizm 
Val34Leu. Wariant 34Leu FXIII jest szybciej aktywowany i przez to szybciej następuje 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 92 z 122
		

/p0093.djvu

			usieciowanie włókien fibryny. Jednakże takie włókna są cieńsze i skrzep fibryny jest mniej 
stabilny [Ariens i wsp., 2000]. Pierwsze badania donosiły o ochronnej roli wariantu 34Leu w 
rozwoju zakrzepicy żylnej [Catto i wsp., 1999]. Późniejsze jednakże badania nie 
potwierdziły tego spostrzeżenia (współczynnik ryzyka 0,63; 95%P.U. 0,46-0,86) [Wells i 
wsp., 2006]. Ostatnio stwierdzono, że efekt ochronny zależy od stężenia fibrynogenu 
[Vossen i wsp., 2005]. Wysokie stężenie fibrynogenu powoduje powstawanie mniej 
porowatego skrzepu fibryny i wydaje się działać synergistycznie z wariantem FXIII 34Leu, 
ochronnie przeciw zakrzepicy żylnej. Inny polimorfizm opisano w podj ednostce B FXIII. 
Jest to białko nośnikowe dla FXIII i dysocjuje po aktywacji FXIII. Wariant 8259A>G 
(Hżs95Arg) powoduje wzrost dysocjacji i lekki wzrost ryzyka wystąpienia zakrzepicy żylnej 
(tabela 31) [Komanasin i wsp., 2005]. 
W 2005 roku kilku badaczy doniosło o związku pomiędzy genotypem grup krwi i 
zakrzepicą żylną [Morelli i wsp., 2005; Koster i wsp., 1995; Mercier i wsp., 2005; Schleef i 
wsp., 2005; Tirado i wsp., 2005]. Grupy krwi układu ABO są związane z pOZIOmem 
zarówno F VIII, jak i czynnika von Willebranda. Niższe ryzyko zakrzepicy żylnej dla 
fenotypu grupy O rozpoznał Jick i wsp. w 1969 roku [Jick i wsp., 1969]. Efekt ochronny 
grupy krwi O jest głównie tłumaczony niskim stężeniem FVIII [Morelli i wsp., 2005; Koster 
i wsp., 1995]. Wszystkie badania potwierdzają niższe ryzyko dla grupy krwi O (genotypy 
0 1 0 1 i 0 1 0 2 ) i wyższe ryzyko dla nosicieli allela A l. Genotyp grupy krwi Oj est związany z 
niższym poziomem FVIII i vWF [Schleefi wsp., 2005; Tirado i wsp., 2005]. Efekt ochronny 
jest ograniczony do homozygotycznych nosicieli alleli O. 
Zmniej szone nasilenie procesu fibrynolizy może pełnić rolę w rozwOJU zakrzepicy 
tętniczej i żylnej. W śród pacj entów, u których stwierdzono uprzednio zakrzepicę żył 
głębokich częściej obserwowano także osłabioną zdolność fibrynolityczną, głównie 
spowodowaną wzrostem poziomu inhibitora aktywatora plazminogenu-l (PAl-I) [Lijnen, 
2005]. W krążącym osoczu PAI-I jest obecny w molowym nadmiarze nad tkankowym 
aktywatorem plazminogenu (tPA) i nadmiar ten jest przewidziany aby zapobiegać 
rozwojowi ogólnoustrojowej fibrynolizy i aby umożliwić lokalną lizę skrzepu bez 
ogólnoustrojowego krwawienia. W ten sposób PAI-I wydaje się być najważniejszym 
czynnikiem decydującym o regulacji procesu fibrynolizy. Badane są czynniki zarówno 
genetyczne, jak i środowiskowe związane z syntezą PAl. Różne czynniki jak 
glukokortykoidy, cytokiny, lipopolisacharydy insulina i enzym konwertaza angiotensyny 
modulują syntezę P AI-I w miejscu transkrypcji [Lijnen, 2005]. 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 93 z 122
		

/p0094.djvu

			Hypofibrynoliza spowodowana polimorfizmem 4G/5G genu PAI-I wydaje SIę być 
niezależnym znaczącym czynnikiem wystąpienia poronień, preeklampsji, 
wewnątrzmacicznego zahamowania wzrostu płodu, odklejenia łożyska oraz 
wewnątrzmacicznego zgonu płodu i prawdopodobnie jest to spowodowane poprzez 
zakrzepową indukcją niewydolności łożyska (tabela 31) [Glueck i wsp., 2000]. Odbiegająca 
od normy ekspresja P Al-I, głównego inhibitora fibrynolizy, może przyczyniać się do 
występowania poronień nawracających poprzez sprzyjanie depozycji fibryny we wczesnym 
krążeniu łożyskowym lub również poprzez ograniczenie rozwoju trofoblastu [Buchholz i 
wsp.,2003]. 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 94 z 122
		

/p0095.djvu

			Tabela 31. Geny mogące wpływać na rozwój zakrzepicy żylnej i powikłań w przebiegu ciąży [wg Bezemer i wsp. 2007]. 


4266A>G Thr312 Ala 0,26(G) redukuje siłę tworzenia skrzepu 1,8 
10034C>T(FGG-H2) 0,26(T) alternatywny sp1ajsing białka 2,4 
19911A>G 0,49(G) wyższy poziom białka 1,4 
6755A>G (HR2) Asp2194Gly 0,07(G) obniża aktywność kofaktora FV 1,2 (nosiciele) 
94901C>G Asp2194G1u O,lS(G) niższy poziom białka 0,6 (nosiciele) 
HTI 0,14(HTl) niższy poziom białka 0,4 (mężczyźni) 
46C>T O,lS(T) niższy poziom białka Nie powtarzane 
G>T Va134Leu 0,24(T) wyższa aktywność białka 0,6 
8259A>G His9SArg 0,08(T) wyższa aktywność białka 1,S (nosiciele) 
1208 I/D 0,S2(D) niższy poziom białka 0,7 
1601G>A GlyS11 G1y 0,04(A) osłabiona inhibicj a fibrynolizy Nie powtarzane 
I/D O,Sl(D) wyższy poziom białka Nie wyj aśnione 
536C>T Pro lSlLeu <0,01 (D) meznany Nie powtarzane 
-33T>C 0,36(C) wyższy poziom białka 0,6 
4600A>G Ser219Gly 0,08(G) wyższy poziom sEPCR Nie wyj aśnione 
4678G>C 0,34(C) wyższy poziom APC Nie wyj aśnione 


4G/5G (D/I) 
505G>A 


niższy poziom białka 
wyższy poziom białka 


Nie wyj aśnione 
0,7 


A1a147Thr 


0,S4(5G) 
0,30(T) 


° 
728C> T 
677C>T 


niższy poziom FVIII/vWF 
niższy poziom białka 
niższa aktywność białka 


0,6 
3,3 (nosiciele) 
Nie wyj aśnione 


0,43(0) 
<0,01(T) 
0,24(T) 


Arg67 Stop 
A1a222Va1 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 9S z 122
		

/p0096.djvu

			5.5. Ogólne zasady profilaktyki przeciwzakrzepowej u ciężarnych z 
trombofilią wrodzoną 


W chwili obecnej u kobiet ze stwierdzoną trombofilią wrodzoną sugeruje się stosowanie 
profilaktyki przeciwzakrzepowej aby przeciwdziałać występowaniu powikłań położniczych 
(poronienia samoistne, wewnątrzmaciczne obumarcie płodu, poród przedwczesny, IUGR, 
stan przedrzucawkowy) oraz aby zapobiec powikłaniom zakrzepowo- zatorowym. 
Obecnie w profilaktyce przeciwzakrzepowej stosuje się heparynę drobnocząsteczkową 
(LMWH ang. low molecular weight heparin), doustne antykoagulanty, leki hamujące 
czynność krwinek płytkowych oraz leki trombolityczne. Mechanizm ich działania na układ 
hemostazy ilustruje ryc. 12. 


Ryc. 12. Mechanizm działania leków przeciwzakrzepowych na układ hemostazy [wg Psuja, 
1999] 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 96 z 122
		

/p0097.djvu

			Działanie przeciwkrzepliwe heparyy jest spowodowane unieczynnianiem przez nią trombiny 
oraz innych czynników krzepnięcia (IXa Xa" XIa, XIIa, VIIa), przede wszystkim za 
pośrednictwem antytrombiny III, ale również przy udziale kofaktora heparyny II i inhibitora 
zewnątrzpochodnej drogi krzepnięcia (TFPI) [Psuj a, 1999]. 
Najczęściej stosowanymi LMWH są: enoksaparyna (Clexane), nadroparyna (Fraxiparine, 
Fraxodi), oraz dalteparyna (Fragmin). Inne preparaty LMWH to: rewiparyna (Clivarin), 
certoparyna (Troparin), parnaparyna (Fluxum). Preparaty te są solami sodowymi heparyny z 
wyjątkiem nadroparyny, która jest solą wapniową. Heparyny drobnocząsteczkowe powstają 
w procesie enzymatycznej lub chemicznej depolimeryzacji heparyny, w wyniku której 
powstają cząsteczki wielkości około 1/3 cząsteczki heparyny niefrakcjonowanej . Ponieważ 
powstają w różnych procesach depolimeryzacji i do pewnego stopnia różnią się 
właściwościami farmakokinetycznymi oraz profilem działania antykoagulacyjnego, sugeruje 
się niekiedy, że nie są to preparaty całkowicie klinicznie zamienne. Różnice w działaniu 
antykoagulacyjnym, farmakokinetyce i innych właściwościach biologicznych między 
LMWH a UPH można wyjaśnić stosunkowo słabszym wiązaniem LMWH z białkami 
osocza. LMWH mają mniejszą od UPH zdolność unieczynniania trombiny, ponieważ ich 
cząsteczki w mniejszym stopniu łączą się jednocześnie z AT i trombiną. Natomiast, prawie 
równie dobrze jak większe cząsteczki, inaktywują czynnik Xa. LMWH mają dłuższy okres 
biologicznego półtrwania w osoczu i lepszą biodostępność w małych dawkach niż UPH oraz 
bardziej przewidywalną zależność efektu od dawki [Hirsh i wsp., 2000]. 
Heparyna nie wchłania się z przewodu pokarmowego dlatego lek podaje się podskórnie lub 
dożylnie. Może powodować działania niepożądane (krwawienia, małopłytkowość 
immunologiczną wywołana przez heparynę - HIT, osteoporozę). U kobiet ciężarnych 
głównym antykoagulantem są heparyny, ponieważ nie przenikaj ą przez łożysko. 
Doustne antykoagulanty przenikaj ące przez barierę łożyskową, mogą powodować 
embriopatię kumarynową zwłaszcza podawane pomiędzy 6 i 12 tygodniem ciąży. W okresie 
połogu i karmienia piersią można stosować heparynę oraz antykoagulanty doustne, które są 
wygodniejsze w stosowaniu i nie przenikają do pokarmu (warfaryna, acenokumarol) lub 
przenikają w bardzo małym stopniu (fenprokumon). W Polsce najczęściej stosowny jest 
acenokumarol. 
Nie ma zgodności odnośnie do wielkości dawek stosowanych w profilaktyce u 
ciężarnych z wrodzoną trombofilią. Nie do końca poznane mechanizmy utarty ciąż w tym 
zespole sprawiają, że dawki stosowane w profilaktyce u kobiet ciężarnych są na obecnym 
etapie dyskusyjne [Skrzypczak, 2008]. 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 97 z 122
		

/p0098.djvu

			W badaniach Grisa i wsp. porównywano stosowanie samej heparyny drobnocząsteczkowej 
( 40mg dziennie) do rezultatów stosowania tylko kwasu acetylosalicylowego (IOOmg 
dziennie) wykazując większą skuteczność stosowania LMWH w zapobieganiu wystąpienia 
powikłań w ciąży (większy procent żywych urodzeń w grupie kobiet stosujących LMWH) 
[Gris i wsp., 2004]. Badania ze stosowaniem tylko kwasu acetylosalicylowego prowadzono 
w dwóch grupach kobiet, w jednej podawano 75mg ASA codziennie od 5 tyg. ciąży do 
końca czasu jej trwania, w drugiej grupIe me stosowano żadnej profilaktyki 
przeciwzakrzepowej. W grupie kobiet z późnymi poronieniami w wywiadzie, które 
przyjmowały aspirynę spostrzeżono wyraźnie wyższy wskaźnik żywych urodzeń (64,6%) w 
porównaniu do grupy kobiet nie przyjmujących aspiryny (49,2%) [Rai i wsp., 2000]. Na 
etapie obecnych badań naukowych prowadzonych w różnych centrach na całym świecie nie 
jest możliwa obiektywna ocena, który schemat profilaktyki (podawanie każdego z leków 
osobno, czy schemat łączenia leków) jest najbardziej korzystny w tej grupie pacjentek. Nie 
wypracowano również optymalnych dawek leków podawanych w profilaktyce. Często u 
pacjentek z poronieniami nawykowymi włączana jest profilaktyka przeciwzakrzepowa na 
zasadzie wcześniejszych doświadczeń praktykujących położników. Wydaje się więc, że 
najbardziej istotne jest wczesne wdrożenie profilaktyki i jej regularne stosowanie przez cały 
okres ciąży. W większości badań proponuje się dołączenie kwasu acetylosalicylowego ze 
względu na spostrzeżenie przytaczane przez niektórych autorów, że kwas acetylosalicylowy 
transportowany przez łożysko zapobiega powstawaniu zakrzepów po płodowej stronie 
krążenia maciczno-łożyskowego (tab. 32). Rutynowo odstawienie profilaktyki 
przeciwzakrzepowej proponowane jest na około 24 godziny przed przewidywanym czasem 
porodu i ponowne jej włączenie w czasie połogu. W czasie połogu proponuje się stosowanie 
u wszystkich pacjentek heparyny drobnocząsteczkowej lub doustnych antykoagulantów 
przez 6 tygodni. 
Kobietom z hiperhomocysteinemią (stężenie przekraczające 16 /l m 0111 osocza) zaleca się 
zarówno przed planowaną ciążą jak i przez całą ciążę suplementację kwasem foliowym. 
Hiperhomocysteinemia u matki poza komplikacjami podczas ciąży, jest związana również z 
chorobami wrodzonymi noworodków, takimi jak: wady cewy nerwowej, rozszczep wargi i 
podniebienia, czy też zespół Downa [Steegers-Theunissen i wsp., 1994, Padmanabhan, 
2006]. Dlatego tak ważne jest, aby już w okresie poprzedzającym ciążę stosować kwas 
foliowy i inne witaminy z grupy B. Jest to szczególnie istotne w pierwszym trymestrze, 
kiedy rozwija się układ nerwowy płodu. 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 98 z 122
		

/p0099.djvu

			W Polsce zaleca się wszystkim kobietom w wieku rozrodczym spożywanie. 0,4 mg kwasu 
foliowego dziennie. U pacjentek nosicielek genotypu homozygotycznego TT, w zakresie 
polimorfizmu 677C>T w genie MTHFR, u których poziom homocysteiny jest znacząco 
podwyższony, jest profilaktyczne podawanie kwasu foliowego w dawkach 5 mg/dobę oraz 
dodatkowa suplementacj a witaminą B l oraz B 12 przez cały czas trwania ciąży, j ak również 
przed zajściem w ciążę (do około 3 miesięcy) (tab. 32). 
Nie ma jak dotąd żadnych sugestii, co do postępowania profilaktycznego u pacjentek 
nosicielek zmutowanych alleli 1298C i 1793A co spowodowane jest głównie małą liczbą 
badań. 
Należy Jeszcze raz podkreślić, że obecność genotypów zmutowanych obydwu 
polimorfizmów 1298A>C oraz 1793G>A podwyższa stężenie homocysteiny. W 
prezentowanej pracy zaobserwowano istotny statystycznie udział polimorfizmu 1793G>A 
genu MTHFR w etiologii poronień nawracających, głównie we wczesnym okresie I 
trymestru ciąży. Ponieważ jest to pierwsza tego typu obserwacja nie można porównać 
wyników z innymi pracami, dlatego niezbędne są dalsze badania w większej grupie kobiet z 
poronieniami jak również badania dotyczące wpływu tego polimorfizmu na strukturę białka 
reduktazy metylenotetrahydrofolianwej i stężenie homocysteiny w osoczu. 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 99 z 122
		

/p0100.djvu

			Tabela 32. Postępowanie u kobiet ciężarnych zagrożonych utratą ciąży wg [Łopaciuk i wsp. 
2002). 


nawykowe poronienia (2':3) 


APSi 
a) co najmniej 2 wczesne poronienia lub 
b) co najmniej l późne poronienie lub c) stan 
przedrzucawkowy, wewnątrz- maciczne 
zahamowanie wzrostu płodu lub oddzielenie 
łożyska 
homozygoty pod względem termolabilnego 
wariantu reduktazy 
metylenotetrahydrofolianowej (677C> 1) 
wrodzona trombofilia i 
a) nawykowe poronienia lub 
b) utrata ciąży w II trymestrze lub później lub 
c) stan przedrzucawkowy, wewnątrz- macicz 
zahamowanie wzrostu płodu lub oddzielenie 
łożyska w wywiadach 


oznaczyć APS (przeciwciała 
antyfosfolipidowe); jeśli co najmniej l 
poronienie miało miej sce w II trymestrze 
ciąży, należy wykonać badania w kierunku 
wrodzonej trombofilii; u kobiet, które 
przebyły ciężki lub nawracający stan 
przedrzucawkowy, albo u których doszło d 
zahamowania wewnątrzmacicznego wzrost 
płodu, oddzielenia łożyska lub obumarcia 
płodu o nieznanej przyczynie - należy 
wykonać badania w kierunku wrodzonej 
trombofilii i APS. 
do porodu kwas acetylosalicylowy (60-150 
mg/d) i podskórne wstrzyknięcia UFH w 
małej lub średniej dawce lub LMWHw 
dawce zapobiegawczej 


suplementacja kwasu foliowego przed 
zaj ściem w ciążę, jeśli kobieta już jest w 
ciąży - to możliwie jak najszybciej 
rozważyć leczenie: kwas acetylosalicylowy 
w małej dawce i podskórne wstrzyknięcia 
UPH w małej dawce lub L WMH w dawce 
zapobiegawczej; po porodzie acenokumarol 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 100 z 122
		

/p0101.djvu

			5.6. Podsumowanie 


Wystąpienie poronień nawracających u kobiet ma duże znaczeme medyczne, 
psychologiczne i społeczne, stąd wiele badań skupia się nie tylko nad właściwym ich 
leczeniem, ale przede wszystkim nad wyjaśnieniem przyczyn występowania poronień. 
Jednocześnie lekarze klinicyści definiują poronienia nawracające jako 2 lub więcej utraty 
ciąży, co powoduje znaczny wzrost skali problemu z 1% do 5% wszystkich par starających 
się o dziecko. Istnieją też sugestie, że poronienie nawracające jest osobną jednostką 
kliniczną ze względu na wyższą obserwowaną częstotliwość poronień nawracających (l %) 
w porównaniu do oczekiwanego ryzyka populacyjnego (0,34%). Odrębność etiologiczna 
sugerowana jest także specyficzną charakterystyką rozrodczą dotyczącą kobiet z 
poronieniami nawracającymi oraz dodatkowym spostrzeżeniem, że ryzyko wystąpienia 
następnego poronienia u kobiety jest głównie związane z wynikiem jej poprzednich ciąż. 
Równolegle więc do innych badań wyjaśniających przyczyny poronień obecnie szczególnie 
intensywnie analizuje się molekularne mechanizmy prowadzące do poronień nawracających, 
między innymi udział mutacji Leiden, mutacji PTM oraz polimorfizmów genu MTHFR w 
mechanizmie ich powstawania. Ścisły związek wymienionych wariantów genetycznych 
został potwierdzony w etiopatogenezie poronień w drugim trymestrze ciąży, jak również 
późnych strat ciąż w trzecim trymestrze. Brak jest natomiast analiz w dużych liczenie 
grupach pacjentek, u których poronienie nastąpiło w pierwszym trymestrze ciąży. Niewiele 
jest także badań porównawczych dotyczących wpływu polimorfizmów genetycznych na 
wystąpienie poronień pomiędzy populacjami należącymi do rasy kaukaskiej a populacjami 
rasy azjatyckiej czarnej z uwzględnieniem modulującego wpływu czynników 
środowiskowych. Wyniki przedstawione w niniejszej pracy wpisują się w szereg prac 
poszukujących udziału wariantów genetycznych związanych ze zwiększonym ryzykiem 
występowania poronień nawracających i potwierdzają możliwość ich wie1ogenowego 
charakteru. 
Intensywnie prowadzone badania nad tym problemem i wskazywane implikacje 
kliniczne w przyszłości pomogą w pełni zidentyfikować geny odpowiedzialne za 
wystąpienie poronień, wyjaśnić interakcje na poziomie molekularnym i wypracować 
odpowiednie metody profilaktyki i leczenia poronień nawracających. 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 101 z 122
		

/p0102.djvu

			6. WNIOSKI 


l. Częstość występowania polimorfizmu 1793G> A reduktazy 
metylenotetrahydrofolianowej (MTHFR) w grupie kobiet z poronieniami nawracającymI 
wskazuje, że polimorfizm ten jest czynnikiem zwiększonego ryzyka wystąpienia poronień 
nawracających w pierwszym trymestrze ciąży. 
2. Analiza wyników sugeruje możliwy wpływ mutacji Leiden (1691G>A) i mutacji 
protrombiny (20210G>A) w mechanizmie poronień nawracających w pierwszym trymestrze 
ciąży. 
3. W pracy wskazano na możliwy udział polimorfizmu 1793G>A genu reduktazy 
metylenotetrahydrofolianowej (MTHFR) w etiologii poronień nawracających we wczesnym 
okresie, natomiast mutacji Leiden (1691G> A) w późnym okresie I trymestru ciąży. 
4. Analiza korelacji genotypów wszystkich trzech polimorfizmów genuMTHFR (677C>T, 
1298A>C, 1793G>A) wykazała przewagę występowania kombinacji genotypów 
heterozygotycznych (zawierających jeden zmutowany allel) w grupie kobiet z poronieniami, 
co wskazuje na możliwą potencjalizację działania połączenia genotypów 
heterozygotycznych w patomechanizmie poronień nawracających. 
5. Zauważona tendencja do częstszego występowania haplotypów genu MTHFR 
zawierających dwa lub trzy zmutowane allele wskazuje na możliwość sumowama SIę 
efektów wpływu tych alle1i na występowanie poronień nawracających. 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 102 z 122
		

/p0103.djvu

			7. STRESZCZENIE 


Poronienie czyli przedwczesne zakończenie ciąży, na skutek wydalenia jaja płodowego z 
macicy przed 22 tygodniem jej trwania, należy do naj częstszych powikłań ciąży. Gdy mamy 
do czynienia z więcej niż trzema następującymi po sobie poronieniami w jednym związku 
partnerskim według definicji WHO możemy uznać je za poronienia nawracające. Natomiast 
zgodnie z rekomendacjami Polskiego Towarzystwa Ginekologicznego (2005, 2008) już 
wystąpienie dwóch następujących po sobie poronień w wywiadzie powinno skłaniać do 
rozszerzenia diagnostyki u kobiet dotkniętych tym powikłaniem. 
Coraz częściej uważa się, że przyczyną poronień mogą być zaburzenia układu krzepnięcia 
matki prowadzące do wystąpienia zmian zakrzepowych uwarunkowanych wystąpieniem 
trombofilii nabytej lub wrodzonej. Najczęściej wymieniane przyczyny trombofilii wrodzonej 
to: mutacja czynnika V typu Leiden, polimorfizm genu protrombiny 20210G>A, 
polimorfizm reduktazy metylenotetrahydrofolianowej (MTHFR), niedobory białek C, S oraz 
antytrombiny III. 
Celem pracy była ocena częstości występowania oraz znaczenia obecności polimorfizmów 
w genach kodujących czynnik V (1691G>A) i czynnik II (20210G>A) krzepnięcia oraz 
enzym reduktazę metylenotetrahydrofolianową (MTHFR, 677C>T, 1298A>C, 1793G>A) w 
grupie kobiet z dwoma lub więcej poronieniami w I trymestrze ciąży. 
Badania przeprowadzono w dwóch grupach kobiet: 11 z obciążonym wywiadem w kierunku 
występowania poronień (dwu lub więcej) w I trymestrze ciąży (104 osoby) oraz 21 kobiet z 
nieobciążonym wywiadem położniczym (169 osób), u których wykluczono występowanie 
poronień oraz potwierdzono obecność, co najmniej jednej ciąży donoszonej, zakończonej 
urodzeniem zdrowego noworodka. Do badań zastosowano łańcuchową reakcję polimerazy 
(PCR) oraz metodę polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (RPLP). 
Na początku pracy analizowano częstość występowania genotypów i alle1i badanych 
wariantów polimorficznych w całej grupie 104 kobiet z dwoma lub więcej poronieniami 
oraz w grupIe kontrolnej. Zaobserwowano tendencję częstszego występowania 
zamutowanych genotypów w grupie kobiet z poronieniami w porównaniu z grupą kontrolną 
głównie w zakresie polimorfizmów genu protrombiny oraz genu MTHFR. Najciekawsze 
wyniki zaobserwowano w zakresie polimorfizmu 1793G>A genu MTHFR, gdzie 
stwierdzono istotną statystycznie przewagę występowania genotypu heterozygotycznego GA 
15,38% w grupie z poronieniami do 4,14% grupie kontrolnej (p=0,001; WR=4,21). 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 103 z 122
		

/p0104.djvu

			W dalszej analizie wyników podzielono grupę 104 kobiet z dwoma lub więcej poronieniami 
na dwie podgrupy ze względu na ilość występujących u nich poronień (80 kobiet, u których 
wystąpiły 2 poronienia i 24 pacjentek, u których występowały 3 lub więcej poronienia w 
wywiadzie). W zakresie polimorfizmu genu protrombiny zaobserwowano w podgrupie 
kobiet z trzema i więcej poronieniami zdecydowaną przewagę (mimo braku istotności 
statystycznej) występowania genotypu heterozygotycznego. Wartość ta wynosiła 8,33% i 
1,18% w grupie kontrolnej. W genie MTHFR zaobserwowano częstsze występowanie 
genotypów heterozygotycznych oraz homozygotycznych zmutowanych w zakresie 
polimorfizmów 677C>Ti 1298A>C. Natomiast w polimorfizmie 1793G>A w grupie kobiet 
z dwoma poronieniami wystąpiła przewaga genotypu heterozygotycznego 16,25 do 4,14% w 
grupie kontrolnej. Różnica była istotna statystycznie p=O,OO1. W podgrupie kobiet z trzema i 
WIęcej poronieniami również zaobserwowano znaczną przewagę występowania 
heterozygotycznych genotypów, pomimo braku istotności statystycznej. Wartości wynosiły 
odpowiednio 12,5% do 4,14% w grupie kontrolnej. 
W kolejnym etapie badań grupę 104 pacjentek z poronieniami podzielono na pacjentki, u 
których występowały tylko poronienia we wczesnym okresie I trymestru ciąży (6-10 tc, 65 
osób, podgrupa A) pacjentki, u których występowały tylko poronienia w późniejszym 
okresie I trymestru (11-13 tc., 16 osób, podgrupa B). Wydzielono również podgrupę kobiet, 
wśród których odnotowano występowanie zarówno poronień we wczesnym, jak i późnym 
okresie I trymestru (6-12 tc., 23 osoby, podgrupa C). Analizując w tych podgrupach 
polimorfizm 1691G>A czynnika V krzepnięcia krwi zaobserwowano pomimo braku różnic 
istotnych statystycznie znacznie częstsze występowanie genotypów zawierających 
przynajmniej jeden zmutowany allel w podgrupie kobiet, u których poronienia wystąpiły w 
późnym okresie I trymestru ciąży w porównaniu z grupą kontrolną (12,5 VS. 6,51%). 
Ciekawą obserwacją było również odnotowanie znacznej przewagi występowania genotypu 
GA polimorfizmu 1793G>A MTHFR w podgrupie kobiet z poronieniami pomiędzy 6 a 10 
tygodniem ciąży w porównaniu do grupy kontrolnej (15,38 VS. 4,14%, p=0,005, WR= 4,21) 
oraz w podgrupie kobiet z obydwoma rodzajami poronień (21,74 VS. 78.26%, p=O, 007, 
WR=6,43). 
W następnym etapie pracy badano współwystępowanie genotypów wszystkich badanych w 
pracy polimorfizmów. Najciekawsze wyniki uzyskano badając współwystępowanie 
genotypów polimorfizmów genu MTHFR gdzie wszystkie uzyskane wyniki były 
statystycznie istotne. Zwrócono uwagę na znaczną, statystycznie istotną przewagę 
współwystępowania heterozygot: CTIAC (67711298 MTHFR) (28,85% w grupie poronień vs. 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 104 z 122
		

/p0105.djvu

			15,98%, p=0,02) oraz ACIGA (1298/1793 MTHFR) (12,50% w grupie poronień vs. 3,55%; 
p=0,008). Interesującą obserwacją była obecność współwystępowania genotypów 
heterozygotycznych CTIGA (677/1793 MTHFR) w grupie kobiet z poronieniami aż w 9,61% 
podczas gdy nie występowały one w grupie kontrolnej (p=0,02). 
W pracy badano także częstość występowania haplotypów wszystkich trzech badanych 
polimorfizmów genuMTHFR. W obu grupach pacjentek (z dwoma lub więcej poronieniami 
i kontrolnej) zaobserwowano występowanie siedmiu haplotypów. Zauważono tendencję do 
częstszego występowania haplotypów CCA, TCG, TCA (zawierających dwa lub trzy 
zmutowane warianty) w grupie kobiet z poronieniami. W grupie kontrolnej częściej 
występującymi haplotypami okazały się CAG, CCG, CAA (zawierające tylko jeden 
zmutowany wariant lub wszystkie warianty typu dzikiego). Zaobserwowano także 
występowanie aż u 7 pacjentek z grupy z dwoma lub więcej poronieniami występowanie 
haplotypu TCA (zawierającego trzy zmutowane warianty), który nie wystąpił u żadnej 
pacj entki z grupy kontrolnej. 
Podsumowuj ąc, częstość występowania polimorfizmu 1793G> A reduktazy 
metylenotetrahydrofolianowej w grupie kobiet z poronieniami nawracającymi wskazuje, że 
polimorfizm ten jest czynnikiem zwiększonego ryzyka wystąpienia poronień nawracających 
w pierwszym trymestrze ciąży. Analiza wyników sugeruje możliwy wpływ mutacji Leiden 
(1691G>A) i mutacji protrombiny (20210G>A) w mechanizmie poronień nawracających w 
pierwszym trymestrze ciąży. W pracy wskazano na możliwy udział polimorfizmu 1793G>A 
genu MTHFR w etiologii poronień nawracających we wczesnym okresie, natomiast mutacji 
Leiden (1691G>A) w późnym okresie I trymestru ciąży. Analiza korelacji genotypów 
wszystkich trzech polimorfizmów genu MTHFR (677C>T, 1298A>C, 1793G>A) wykazała 
przewagę występowania kombinacji genotypów heterozygotycznych (zawierających jeden 
zmutowany allel) w grupie kobiet z poronieniami, co wskazuje na możliwą potencjalizację 
działania połączenia genotypów heterozygotycznych w patomechanizmie poronień 
nawracających. Zauważona tendencja do częstszego występowania haplotypów genu 
MTHFR zawierających dwa lub trzy zmutowane allele wskazuje na możliwość sumowania 
się efektów wpływu tych alle1i na występowanie poronień nawracających. 
W powyższym badaniu pokazano, że polimorfizmy genetyczne związane z wrodzonymi 
trombofiliami są bardzo ważnym czynnikiem wpływającym na występowanie poronień 
nawracających. Badanie to również sugeruje także celowość włączenia profilaktyki 
przeciwzakrzepowej w przeypadku poronień nawracających zgodnie ze stwierdzonym 
indywidualnym genotypem kobiety. 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 105 z 122
		

/p0106.djvu

			8. SUMMARY 


The miscarriage is a premature termination of pregnancy by the removal or expulsion of an 
embryo or fetus from the uterus before 22 weeks of gestation. This condition is the most 
common complication of early pregnancy. More than three following mi scarriages, 
according to WHO criteria, should be recognized as recurrent miscarriages. However, 
according to recommendations of Polish Gynecological Society (2005, 2008) occurrence in 
obstetrical anamnesis of two or more miscarriages require the extended diagnostics in 
women with this condition. 
It is current1y believed that the important reason of abortion are disturbances of maternal 
clothing system leading to occurrence of thrombotic abnormalities conditioned by the 
presence of acquired or inherited thrombophilias. The most frequent reasons of inherited 
thrombophilia are: factor V Leiden mutation, 20210G>A polymorphism of prothrombin 
gene, polymorphism of methylenetetrhydrofolate reductase (MTHFR) gene, polymorphisms 
leading to deficiency of protein C, protein S, and antithrombin III. 
The aim of this study was to investigate frequency and significance of polymorphisms in 
genes coding for factor V (1691G > A) and factor II (20210G > A) of coagulation cascade 
and methylenetetrhydrofolate reductase (MTHFR, 677C > T, 1298A > C, 1793G > A) in a 
group ofwomen with two or more miscarriages in first trimester ofpregnancy. 
The investigations were conducted in two groups of women: II with anamese history of 
miscarriages occurrence (two or more) in first trimester of pregnancy (104 persons) and 21 
women with correct obstetrical anamnesis (169 persons) with excluded occurrence of 
pregnancy loss and confirmed presence of at least one pregnancy ended with healthy child 
birth. The genetic analysis was performed by polymerase chain reaction (PCR) and 
restriction fragment length polymorphism (RPLP) method from DNA obtained from nuclear 
blood cells. 
As a main step the frequency of genotypes and alle1es of studied polymorphic variants in the 
whole group of 104 women with two or more pregnancy loss and in the controls has been 
analyzed. It was observed tendency to more frequent occurrence of mutated genotyp es in 
women with miscarriages in comparison to the control group, mainly in polymorphisms of 
the prothrombin and MTHFR genes. The most interesting results were observed for 
1793G>A polymorphism of MTHFR gene, where statistically significant overrepresentation 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 106 z 122
		

/p0107.djvu

			was observed for GA genotype of 1793G>A polymorphism in group with miscarriage (15,38 
%) if compared to controls (4,14 %, P = 0,001; OR = 4,21). 
For further analysis the group of 104 women with miscarriages was divided in subgroups: 80 
women with 2 miscarriages and 24 patients with 3 or more miscarriages in anamnesis. 
Investigation of 20210G>A polymorphism of prothrombin gene in the subgroup of women 
with three and more miscarriages shown high overrepresentation of heterozygous genotypes 
(8,33 % and 1,18 % in the control group, ns). More frequent occurrence ofheterozygous and 
mutated homozygous genotyp es of 677C> T and 1298A>C polymorphisms in MTHFR gen e 
was observed. However 1793G>A heterozygous in group of women with two miscarriages 
occurs statistically significant higher (16,25%) that in the control group (4,14%). The 
difference was statistically significant (p=O,OOI). In subgroup ofwomen with three and more 
miscarriages considerable the high overrepresentation of heterozygous genotypes was also 
observed (respectively 12,5% to 4,14%, ns). 
If the group of 104 patients were divided according to time of miscarriage: the group with 
miscarriages in early period of first trimester of pregnancy (6-10 weeks, 65 persons, 
subgroup A), miscarriages only in later period of first trimester (11-13 weeks, 16 persons, 
subgroup B), and miscarriages noted both in early and late period of first trimester 
pregnancy (6-12 weeks, 23 persons, subgroup C). In the subgroup ofwomen with pregnancy 
loss in late period of first trimester of pregnancy overrepresentation of genotyp es including 
at least one mutated allele of 1691G>A polymorphism ofFV was observed (12,5 VS. 6,51% 
in control group). The interesting observation was that homozygotes 1793GA of MTHFR 
gene in subgroup of women with miscarriages between 6 and 10 weeks were significant1y 
overrepresented (15,38 VS. 4,14%, OR = 4,21, P = 0,005). In subgroup C it was noted the 
much higher frequency ofheterozygous genotype (21,74 VS. 78.26%, OR = 6,43, P = 0,007). 
In the next stage of investigation the coexistence of particular genotyp es of all studied 
polymorphisms was analysed. The most interesting results were observed in coexistence of 
genotypes of polymorphism in MTHFR gene where all obtained results were significant1y 
different. It was observed the statistically significant overrepresentation in coexistence of 
following heterozygote genotypes combination: CT/AC (677/1298 MTHFR) (28,85% in the 
miscarriage group vs. 15,98%, p = 0,02) and AC/GA (1298/1793 MTHFR) (12,50% in the 
miscarriage group vs. 3,55%; p = 0,008). The interesting observation was the coexistence of 
heterozygote genotypes CT/GA (677/1793 MTHFR) in women with miscarriages up to 9,61 
%, while it was not observed in the control group (p = 0,02). 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 107 z 122
		

/p0108.djvu

			We have also analysed frequency of haplotypes of all three polymorphisms of MTHFR gene. 
In both groups of patients (with two or more pregnancy loss and control) we have found 
seven haplotypes. The tendency to more frequent occurrence of CCA, TCG, TCA haplotypes 
(including two or three mutated variants) in women with miscarriages has been noted. In the 
control group more frequent haplotypes were CAG, CCG, CM (contenning only one 
mutated variant or wild-type variants). In 7 women from the group with miscarriages the 
occurrence of TCA haplotype (including three mutated variants) was noted (not found in the 
controls ). 
In summ ary, the frequency of 1793G>A polymorphism of methylenetetrhydrofolate 
reductase (MTHFR) gen e in women with recurrent miscarriage indicated that this 
polymorphism is risk factor for recurrent miscarriages in first trimester of pregnancy. The 
analysis of obtained results suggests the possible influence of Leiden (1691G>A) and 
prothrombin (20210G>A) mutations on mechanism of recurrent miscarriages in first 
trimester. In analysis it was shown the possible participation of 1793G>A polymorphism of 
MTHFR gene in recurrent miscarriage etiology in early first trimester, and Leiden 
(1691G>A) mutation in late first trimester of pregnancy. Analysis of genotypes correlation 
of all three MTHFR polymorphisms (677C>T, 1298A>C, 1793G>A) showed the 
overrepresentation of heterozygous genotyp es combination (including one mutated allele) 
that indicated possible potentialization of connected heterozygous genotypes patomechanism 
of recurrent miscarriages. The noticed tendency to more frequent occurrence of haplotypes 
of MTHFR gene including two or three mutated allele showed the possibility of summarized 
effect ofthese variants influencing recurrent miscarriage occurrence possibility. 
In this investigation it was shown that genetic polymorphisms connected with inherited 
thrombophilias are very important factor inducing recurrent miscarriages. It could suggest 
that this investigation has shown possible target to underwent antithrombotic prophilaxis of 
recurrent miscarriages according to observed individual genotyp e ofwoman. 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 108 z 122
		

/p0109.djvu

			9. PIŚMIENNICTWO 


l. Abbate R, Sofi F, Gensini F, Fatini C, Sticchi E, Fedi S. Thrombophilias as risk factors 
for disorders of pregnancy and fetal damage. Pathophysiol Haemost Thromb. 
2002;32:318-21. 
2. Adamek Ł, Jankowski M, Sanak M, Krzanowski M, Grzanka P, Nizankowska E, 
Szczeklik A. Współwystępowanie wariantu 20210A genu protrombiny i czynnika V 
Leiden predysponujące do żylnej choroby zakrzepowo-zatorowej, Pol Arch Med Wewn. 
1999;6: 1095-9. 
3. Andersson A, Hultberg B, Brattstram L, Isaksson A. Decreased serum homocysteine in 
pregnancy. Eur J Clin Chem Clin Biochem. 1992;30:377-9. 
4. Ariens RA, Philippou H, Nagaswami C, Weisel JW, Lane DA, Grant PJ. The factor XIII 
V34L polymorphism accelerates thrombin activation of factor XIII and affects cross- 
linked fibrin structure. Blood. 2000;96:988-95. 
5. Aubard Y, Darodes N, Cantaloube M: Hyperhomocysteinemia and pregnancy-review of 
our prezent understanding and therapeutic implications. Eur J Obstet Gynecol Reprod 
Biol. 2000;93:157-65. 
6. Austin H, Hooper WC, Lally C, Dilley A, Ellingsen D, Wideman C, Wenger NK, 
Rawlins P, Silva V, Evatt B.Venous thrombosis in relation to fibrinogen and factor VII 
genes among African-Americans. J Clin Epidemiol. 2000;53:997-1001. 
7. Balasch J, Reverter JC, Fabregues F, Tassies D, Rafel M, Creus M, Vanrell JA. First- 
trimester repeated abortion is not associated with activated protein C resistance. Hum 
Reprod. 1997;12:1094-7. 
8. Bar-Shavit R, Benezra M, Sabbah V, Bode W, Vlodavsky I. Thrombin as a 
multifunctional protein: induction of cell adhesion and proliferation. Am J Respir Cell 
Mol Biol. 1992;6: 123-30. 
9. Bertina RM, Koeleman BP, Koster T, Rosendaal FR, Dirven RJ, de Ronde H, van der 
Ve1den P A, Reitsma PH. Mutation in blood coagulation factor V associated with 
resistance to activated protein C. Nature. 1994; 369, 64-7. 
10. Bertina RM, Poort SR, Vos HL, Rosendaal FR. The 46C-->T polymorphism in the factor 
XII gene (FI2) and the risk ofvenous thrombosis. J Thromb Haemost. 2005;3:597-9. 
11. Bezemer ID, Rosendaal FR. Predictive genetic variants for venous thrombosis: what's 
new? Semin Hematol. 2007;44:85-92. 
12. Bonnette RE, Caudill MA, Boddie AM, Hutson AD, Kauwell GP, Bailey LB. Plasma 
homocyst(e)ine concentrations in pregnant and nonpregnant women with controlled 
folate intake. Obstet Gynecol. 1998;92:167-70. 
13. Bręborowicz GH, Sobieszczyk S. Koagulopatie położnicze. W: Położnictwo i 
ginekologia. Pod red. Bręborowicz GH. PZWL Warszawa, 2005: 151-61. 
14. Bremme KA. Haemostatic changes in pregnancy. Best Pract Res Clin Haematol. 
2003; 16: 153-68. 
15. Brenner B, Blumenfeld Z. Thrombophilia and fetalloss. Blood Rev. 1997; 11 :72-9. 
16. Brenner B, Sarig G, Weiner Z, Younis J, Blumenfeld Z, Lanir N. Thrombophilic 
polymorphisms are common in women with fetal loss without apparent cause. Thromb 
Haemost. 1999a;82:6-9. 
17. Brenner B. Inherited thrombophilia and pregnancy loss. Thromb Haemost. 1999b; 
82:634-40. 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 109 z 122
		

/p0110.djvu

			18. Brenner B, Bar J, Ellis M, Yarom I, Yohai D, Samueloff A; Live-Enox Investigators. 
Effects of enoxaparin on late pregnancy complications and neonatal outcome in women 
with recurrent pregnancy loss and thrombophilia: results from the Live-Enox study. 
Fertil Steril. 2005;84:770-3. 
19. Brockton NT. Localized depletion: the key to colorectal cancer risk mediated by 
MTHFR genotyp e and folate? Cancer Causes Control. 2006;17: 1005-16. 
20. Buchholz T, Lohse P, Rogenhofer N, Kosian E, Pihusch R, Thaler CJ. Polymorphisms in 
the ACE and PAI-I genes are associated with recurrent spontaneous miscarriages. Hum 
Reprod. 2003;18:2473-7. 
21. Carp H, Salomon O, Seidman D, Dardik R, Rosenberg N, Inbal A. Prevalence of genetic 
markers for thrombophilia in recurrent pregnancy loss. Hum Reprod. 2002; 17: 1633-7. 
22. Carp H, Dolitzky M, Inbal A. Thromboprophylaxis improves the live birth rate in 
women with consecutive recurrent miscarriages and hereditary thrombophilia. J Thromb 
Haemost. 2003; l :433-8. 
23. Carter AM, Catto AJ, Kohler HP, Ariens RA, Stickland MH, Grant PJ. alpha-fibrinogen 
Thr312Ala polymorphism and venous thromboembolism. Blood. 2000;96: 1177-9. 
24. Castaman G, Faioni EM, Tosetto A, Bernardi F. The factor V HR2 haplotype and the 
risk ofvenous thrombosis: a meta-analysis. Haematologica. 2003;88:1182-9. 
25. Castoldi E, Simioni P, Kalafatis M, Lunghi B, Tormene D, Gi rell i D, Girolami A, 
Bernardi F. Combinations of 4 mutations (FV R506Q, FV H1299R, FV Y1702C, PT 
20210G/A) affecting the prothrombinase complex in a thrombophilic family. Blood. 
2000;96: 1443-8. 
26. Catto AJ, Kohler HP, Coore J, Mansfield MW, Stickland MH, Grant PJ. Association of a 
common polymorphism in the factor XIII gene with venous thrombosis.Blood. 
1999;93 :906-8. 
27. Ceelie H, Bertina RM, van Hylckama Vlieg A, Rosendaal FR, Vos HL. Polymorphisms 
in the prothrombin gene and their association with plasma prothrombin levels. Thromb 
Haemost. 2001;85: 1066-70. 
28. Chango A, Boisson F, Barbe F, Quilliot D, Droesch S, Pfister M, Fillon-Emery N, 
Lambert D, Fremont S, Rosenblatt DS, Nicolas JP. The effect of 677C-->T and 1298A-- 
>C mutations on plasma homocysteine and 5, 10-methylenetetrahydrofolate reductase 
activity in healthy subjects. Br J Nutr. 2000;83 :593-6. 
29. Chinthammitr Y, Vos HL, Rosendaal FR, Doggen CJ. The association of prothrombin 
A19911G polymorphism with plasma prothrombin activity and venous thrombosis: 
results of the MEGA study, a large population-based case-control study. J Thromb 
Haemost. 2006;4:2587-92. 
30. Comp PC, Nixon RR, Cooper MR, Esmon CT. Familial protein S deficiency is 
associated with recurrent thrombosis. J Clin Invest. 1984;74:2082-88. 
31. Coumans AB, Huijgens PC, Jakobs C, Schats R, de Vries JI, van Pampus MG, Dekker 
GA. Haemostatic and metabolic abnormalities in women with unexplained recurrent 
abortion. Hum Reprod 1999;14:211-14. 
32. Crott JW, Mashiyama ST, Ames BN, Fenech MF. Methylenetetrahydrofolate reductase 
C677T polymorphism does not alter folic acid deficiency-induced uracil incorporation 
into primary human lymphocyte DNA in vitro. Carcinogenesis. 2001;22: 1019-25. 
33. Cui J, Eitzman DT, Westrick RJ, Christie PD, Xu ZJ, Yang AY, Purkayastha AA, Yang 
TL, Metz AL, Gallagher KP, Tyson JA, Rosenberg RD, Ginsburg D. Spontaneous 
thrombosis in mice carrying the factor V Leiden mutation. Blood. 2000;96:4222-6. 
34. Dahlback B, Hansson C, Islam MQ, Szpirer J, Szpirer C, Lundwall A, Levan G 
Assignment of gene for coagulation factor V to chromosome l in man and to 
chromosome 13 in rat. Somat Cell Molec Genet. 1988;14:509-14. 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 110 z 122
		

/p0111.djvu

			35. Degen SJ, Davie EW. Nucleotide sequence of the gen e for human prothrombin. 
Biochemistry. 1987;26:6165-77. 
36. Dizon-Townson DS, Kinney S, Branch DW, Ward K. The factor V Leiden mutation is 
not a common cause ofrecurrent miscarriage. J Reprod Immunol. 1997; 34:217-23. 
37. Domenici FA, Vannucchi MT, Sim5es-Ambrósio LM, Vannucchi H. 
Hyperhomocysteinemia and polymorphisms of the methylenetetrahydrofolate gen e in 
hemodialysis and peritoneal dialysis patients. Mol Nutr Food Res. 2007;51: 1430-6. 
38. Dorszewska J, Florczak J, Rozycka A, Kempisty B, Jaroszewska-Kolecka J, Chojnacka 
K, Trzeciak WH, Kozubski W. Oxidative DNA damage and level of thiols as related to 
polymorphisms of MTHFR, MTR, MTHFDI in Alzheimer's and Parkinson's diseases. 
Acta Neurobiol Exp (Wars). 2007;67: 113-29. 
39. Egeberg O. Inherited antithrombin III deficiency causing thrombophilia. Thromb Diath 
Haemorr.1965;13:516-30. 
40. Faught W, Garner P, Jones G, Ivey B. Changes in protein C and protein S levels in 
normal pregnancy. Am J Obstet Gynecol. 1995;172:147-50. 
41. Finan RR, Tamim H, Ameen G, Sharida HE, Rashid M, Almawi WY. Prevalence of 
factor V Gl69lA (factor V-Lei den) and prothrombin G20210A gen e mutations in a 
recurrent miscarriage population. Am J Hematol. 2002;71 :300-5. 
42. Foka ZJ, Lambropoulos AP, Saravelos H, Karas GB, Karavida A, Agorastos T, 
Zournatzi V, Makris PE, Bontis J, Kotsis A. Factor V Leiden and prothrombin G20210A 
mutations, but not methylenetetrahydrofolate reductase C677T, are associated with 
recurrent miscarriages. Hum Reprod. 2000; 15:458-62. 
43. Franco RP, Reitsma PH, Louren<;o D, Maffei FH, Morelli V, Tavella MH, Araujo AG, 
Piccinato CE, Zago MA. Factor XIII Val34Leu is a genetic factor involved in the 
etiology ofvenous thrombosis. Thromb Haemost. 1999;81:676-9. 
44. Friedman G, Goldschmidt N, Friedlander Y, Ben- Yehuda A, Selhub J, Babaey S, 
Mendel M, Kidron M, Bar-On H. A common mutation Al298C in human 
methylenetetrahydrofolate reductase gene: association with plasma total homocysteine 
and folate concentrations. J Nutr. 1999; 129: 1656-61. 
45. Friso S, Girelli D, Trabetti E, Stranieri C, Olivieri O, Tinazzi E, Martinelli N, Faccini G, 
Pignatti PF, Corrocher R. Al298C methylenetetrahydrofolate reductase mutation and 
coronary artery disease: relationships with C677T polymorphism and 
homocysteine/folate metabolism. Clin Exp Med. 2002;2:7-12. 
46. Frosst P; BIom, H.J; Milos R; Goyette P; Sheppard CA; Matthews RG; Boers GJH; den 
Heijer M; Kluijtmans LAJ; van den Heuvel LP; Rozen R. A candidate genetic risk factor 
for vascular disease: a common mutation in methylenetetrahydrofolate reductase. Nature 
Genet. 1995; 10: 111-3. 
47. Garcia JGN. Molecular mechansiams of thrombin-induced human and bovine 
endothelial cell activation. J Lab Clin Med. 1992; 120:513-9. 
48. Gehring NR, Frede U, Neu-Yilik G, Hundsdoerfer P, Vetter B, Hentze MW, Kulozik 
AE. Increased efficiency of mRNA 3' end formation: a new genetic mechanism 
contributing to hereditary thrombophilia. Nat Genet. 2001;28:389-92. 
49. Girling J, de Swiet M. Acquired thrombophilia. Baillieres Clin Obstet Gynaecol. 
1997; 11 :447-62. 
50. Glueck CJ, Phillips H, Cameron D, Wang P, Fontaine RN, Moore SK, Sieve-Smith L, 
Tracy T. The 4G/4G polymorphism of the hypofibrinolytic plasminogen activator 
inhibitor type l gene: an independent risk factor for serious pregnancy complications. 
Metabolism. 2000;49:845-52. 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 111 z 122
		

/p0112.djvu

			51. Goodman CS, Coulam CB, J eyendran RS, Acosta V A, Roussev R. Which thrombophilic 
gene mutations are risk factors for recurrent pregnancy loss? Am J Reprod Immunol. 
2006;56:230-6. 
52. Gapel W, Ludwig M, Junge AK, Kohlmann T, Diedrich K, Maller l Selection pressure 
for the factor-V-Leiden mutation and embryo implantation. Lancet. 2001;358: 1238-9. 
53. Górniak J, Wachnicki l Pierwsze kroki w analizie danych SPSS PL for Windows. Pod 
red. Górnik J, Wachnicki l SPSS Polska, Kraków 2003. 
54. Goyette P, Sumner JS, Milos R, Duncan AMV, Rosenblatt DS, Matthews RG, Rozen R. 
Human methylenetetrahydrofolate reductase: isolation of cDNA, mapping and mutation 
identification. Nature Genet. 1994;7: 195-200. 
55. Grandone E, Margaglione M, Colaizzo D, d' Addedda M, Cappucci G, Vecchione G, Di 
Minno G. Factor V Leiden is associated with repeated and recurrent unexplained fetal 
losses. Thromb Haemost. 1997;77:822-4. 
56. Grandone E, Margaglione M, Colaizzo D, d'Addedda M, D'Andrea G, Pavone G, Di 
Minno G. Methylene tetrahydrofolate reductase (MTHFR) 677T ----+C mutation and 
unexplained early pregnancy loss. Thromb Haemost 1998;79:1056 -7. 
57. Griffin JH, Evatt B, Zimmerman TS, Kleiss AJ, Wideman C. Deficiency of protein C in 
congenital thrombotic disease. J Clin Invest. 1981;68:1370-3. 
58. Gris JC, Mares P. The long and winding road ... towards LMWH for pregnancy loss. J 
Thromb Haemost. 2005;3:224-6. 
59. Gris JC, Quere I, Monpeyroux F, Mercier E, Ripart-Neveu S, Tailland ML, Hoffet M, 
Berlan J, Daures JP, Mares P. Case-control study of the frequency of thrombophilic 
disorders in couples with late foetal loss and no thrombotic antecedent--the Nimes 
Obstetricians and Haematologists Study5 (NOHA5). Thromb Haemost. 1999;81:891-9. 
60. Gris JC, Mercier E, Quere I, Lavigne-Lissalde G, Cochery-Nouvellon E, Hoffet M, 
Ripart-Neveu S, Tailland ML, Dauzat M, Mares P. Low-molecular-weight heparin 
versus low-dose aspirin in women with one fetalloss and a constitutional thrombophilic 
disorder.Blood. 2004; 103 :3695-9. 
61. GrUnbacher G, Marx-Neuhold E, Pilger E, Koppel H, Renner W.The functional -4C>T 
polymorphism of the coagulation factor XII gene is not associated with deep venous 
thrombosis. J Thromb Haemost. 2005;3:2815-7. 
62. Guenther BD, Sheppard CA, Tran P, Rozen R, Matthews RG, Ludwig ML. The structure 
and properties of methylenetetrahydrofolate reductase from Escherichia coli suggest how 
folate ameliorates human hyperhomocysteinemia. Nat Struct Biol. 1999;6:359-65. 
63. Hanson NQ, Aras O, Yang F, Tsai MY. C677T and Al298C polymorphisms of the 
methylenetetrahydrofolate reductase gene: incidence and effect of combined genotyp es 
on plasma fasting and post-methionine load homocysteine in vascular disease. Clin 
Chem.2001;47:661-6. 
64. Hashimoto K, Shizusawa Y, Shimoya K, Ohashi K, Shimizu T, Azuma C, Murata Y. 
The factor V Leiden mutation in Japanese couples with recurrent spontaneous abortion. 
Hum Reprod. 1999; 14: 1872-4. 
65. Henriksen TB, Hjollund NR, Jensen TK, Bonde JP, Andersson AM, Kolstad H, Ernst E, 
Giwercman A, Skakkebaek NE, Olsen l Alcohol consumption at the time of conception 
and spontaneous abortion. Am J Epidemiol. 2004; 160:661-7. 
66. Hirsh J, Bates SM. The emerging role of low-molecular-weight heparin in cardiovascular 
medicine. Prog Cardiovasc Dis. 2000;42:235-46. 
67. Hohlagschwandtner M, Unfried G, Heinze G, Huber JC, Nagele F, Tempfer C. 
Combined thrombophilic polymorphisms in women with idiopathic recurrent 
miscarriage.Fertil Steril. 2003;79: 1141-8. 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 112 z 122
		

/p0113.djvu

			68. Holmes ZR, Regan L, Chilcott I, Cohen H. The C677T MTHFR gen e mutation is not 
predictive of risk for recurrent fetalloss. Br J Haematol. 1999; 105:98-101. 
69. Homberger A, Linnebank M, Winter C, Willenbring H, Marquardt T, Harms E, Koch 
HG. Genomic structure and transcript variants of the human methylenetetrahydrofolate 
reductase gene. Eur J Hum Genet. 2000;8:725-9. 
70. Hozyasz K, Milanowski A. Hiperhomocysteinemia u chorej na celiakię z 
polimorficznymi allelami (677CT i 1298AC) genu reduktazy 
metylenotetrahydrofolanowej w układzie heterozygotycznym - opis przypadku. Med 
Wieku Rozw. 2002;6:57-61. 
71. Isermann B, Hendrickson SB, Zogg M, Wing M, Cummiskey M, Kisanuki YY, 
Yanagisawa M, Weiler H. Endothelium-specific loss ofmurine thrombomodulin disrupts 
the protein C anticoagulant pathway and causes juvenile-onset thrombosis. J Clin Invest. 
2001; 108:537-46. 
72. Isermann B, Sood R, Pawlinski R, Zogg M, Kalloway S, Degen JL, Mackman N, Weiler 
H. The thrombomodulin-protein C system is essential for the maintenance of pregnancy. 
NatMed.2003;9:331-7. 
73. Isotalo PA, Wells GA, Donnelly JG. Neonatal and fetal methylenetetrahydrofolate 
reductase genetic polymorphisms: an examination of C677T and Al298C mutations. Am 
J Hum Genet. 2000;67:986-90. 
74. James SJ, Melnyk S, Pogribna M, Pogribny IP, Caudill M. Elevation in S- 
Adenosylohomocysteine and DNA Hypomethylation: Potential Epigenetic Mechanism 
for Homocysteine - Related Pathology J Nutr. 2002; 132:2361-6. 
75. Jastrzębska M. Zaburzenia hemostazy w ciąży fizjologicznej i połogu, rola D-Dimerów. 
Aktualności bioMerineux. Biologia molekularna- nowe perspektywy. 2005;35: 13-17. 
76. Jick H, Slone D, Westerholm B, Inman WH, Vessey MP, Shapiro S, Lewis GP, 
Worcester lVenous thromboembolic disease and ABO blood type. A cooperative study. 
Lancet. 1969; 1:539-42. 
77. Kamphuisen PW, Eikenboom JC, Rosendaal FR, Koster T, Blann AD, Vos HL, Bertina 
RM. High factor VIII antigen levels increase the risk of venous thrombosis but are not 
associated with polymorphisms in the von Willebrand factor and factor VIII gene.Br J 
Haematol. 2001; 115: 156-8. 
78. Kanaji T, Okamura T, Osaki K, Kuroiwa M, Shimoda K, Hamasaki N, Niho Y. A 
common genetic polymorphism (46 C to T substitution) in the 5'-untranslated region of 
the coagulation factor XII gene is associated with low translation efficiency and decrease 
in plasma factor XII level.Blood. 1998;91:2010-4. 
79. Kang SS, Wong PW, Zhou JM, Cook HY. Total homocyst(e)ine in plasma and amniotic 
fluid of pregnant women. Metabolism. 1986;35: 889-91. 
80. Kang SS, Zhou J, Wong PW, Kowalisyn J, Strokosch G. Intermediate homocysteinemia: 
A thermolabile variant of methylenetetrahydrofolate reductase. Am J Hum Genet. 
1988;43 :414-21. 
81. Kebert CB, Eichner JE, Moore WE, Schechter E, Yaoi T, Vogel S, Allen RA, Dunn ST. 
Re1ationship of the 1793G-A and 677C-T polymorphisms of the 5,10- 
methylenetetrahydrofolate reductase gene to coronary artery disease. Dis Markers. 
2006;22:293-301. 
82. Kerlin BA, Yan SB, Isermann BH, Brandt JT, Sood R, Basson BR, Joyce DE, Weiler H, 
Dhainaut JF. Survival advantage associated with heterozygous factor V Leiden mutation 
in patients with severe sepsis and in mouse endotoxemia. Blood. 2003; 102:3085-92. 
83. Kesmodel U, Wisborg K, Olsen SF, Henriksen TB, Secher Nl Moderate alcohol intake 
in pregnancy and the risk of spontaneous abortion. Alcohol Alcohol. 2002;37:87-92. 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 113 z 122
		

/p0114.djvu

			84. Khong TY, Hague WM. The placenta in maternal hyperhomocysteinaemia. Br J Obstet 
Gynaecol. 1999; 106:273-8. 
85. Ko YL, Hsu LA, Hsu TS, Tsai CT, Teng MS, Wu S, Chang CJ, Lee YS. Functional 
polymorphisms of FGA, encoding alpha fibrinogen, are associated with susceptibility to 
venous thromboembolism in a Taiwanese population. Hum Genet. 2006; 119:84-91. 
86. Komanasin N, Catto AJ, Futers TS, van Hylckama Vlieg A, Rosendaal FR, Ariens RA. 
Anovel polymorphism in the factor XIII B-subunit (His95Arg): relationship to subunit 
dissociation and venous thrombosis. J Thromb Haemost. 2005;3 :2487-96. 
87. Kopeć M, Łopaciuk S. Hemostaza fizjologiczna. W: Zakrzepy i zatory. Pod red. 
Łopaciuk S. Wydawnictwo Lekarskie PZWL Warszawa 2002,19-52. 
88. Koster T, Rosendaal FR, Reitsma PH, van der Vel den PA, Briet E, Vandenbroucke JP. 
Factor VII and fibrinogen levels as risk factors for venous thrombosis. A case-control 
study of plasma levels and DNA polymorphisms--the Leiden Thrombophilia Study 
(LETS).Thromb Haemost. 1994;71 :719-22. 
89. Koster T, Blann AD, Briet E, Vandenbroucke JP, Rosendaal FR: Role of clotting factor 
VIII in effect of von Willebrand factor on occurrence of deep-vein thrombosis. Lancet 
1995 ;345: 152-5. 
90. Kupferminc MJ, Eldor A, Steinman N, Many A, Bar- Am A, Jaffa A, Fait G, Lessing JB. 
Increased frequency of genetic thrombophilia in women with complications of 
pregnancy. N Engl J Med 1999;340:9-13. 
91. Kupferminc MJ, Fait G, Many A, Gordon D, Eldor A, Lessing JB. Severe preeclampsia 
and high frequency of genetic thrombophilic mutations. Obstet Gynecol 2000;96:45-9. 
92. Kupferminc MJ, Peri H, Zwang E, Yaron Y, Wolman I, Eldor A. High prevalence ofthe 
prothrombin gene mutation in women with intrauterine growth retardation, abruptio 
placentae and second trimester loss. Acta Obstet Gynecol Scand. 2000;79:963-7. 
93. Kutteh WH, Park VM, Deitcher SR. Hypercoagulable state mutation analysis in white 
patients with early first-trimester recurrent pregnancy loss. Fertil Steril 1999;71:1048- 
53. 
94. Lane DA, Bayston T, Olds RJ, Fitches AC, Cooper DN, Millar DS, Jochmans K, Perry 
DJ, Okajima K, Thein SL, Emmerich J. Antithrombin mutation database: 2nd (1997) 
update. For the Plasma Coagulation Inhibitors Subcommittee of the Scientific and 
Standardization Committee of the International Society on Thrombosis and 
Haemostasis.Thromb Haemost. 1997;77: 197-211. 
95. Lane DA, Grant PJ. Role of hemostatic gen e polymorphisms in venous and arterial 
thrombotic disease. Blood. 2000;95:1517-32. 
96. Lashen H, Fear K, Sturdee DW. Obesity is associated with increased risk of first 
trimester and recurrent miscarriage: matched case-control study. Hum Reprod. 
2004; 19: 1644-6. 
97. Le Marchand L, Donlon T, Hankin JH, Kolonel LN, Wilkens LR, Seifried A. B-vitamin 
intake, metabolic genes, and colorectal cancer risk (United States). Cancer Causes 
Control. 2002; 13 :239-48. 
98. Leroyer C, Mercier B, Oger E, Chenu E, Abgrall JF, Ferec C, Mottier D. Prevalence of 
20210 A allele of the prothrombin gen e in venous thromboembolism patients. Thromb 
Haemost. 1998;80:49-51. 
99. Leung LLK. APC Medicine. Thrombotic disorders. Hematology. 2005; 16: 1-16. 
100. Li W, Zheng X, Gu JM, Ferrell GL, Brady M, Esmon NL, Esmon CT. Extraembryonic 
expression ofEPCR is essential for embryonic viability. Blood. 2005; 106:2716-22. 
101. Lijnen HR, Alessi MC, Van Hoef B, Collen D, Juhan-Vague I. On the role of 
plasminogen activator inhibitor-l in adipose tissue development and insulin resistance in 
mice. J Thromb Haemost. 2005;3: 1174-9. 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 114 z 122
		

/p0115.djvu

			102. Lindqvist PG, Zaller B, Dahlback B. Improved hemoglobin status and reduced menstrual 
blood loss among female carriers of factor V Leiden--an evolutionary advantage? 
Thromb Haemost. 2001;86:1122-3. 
103. Lindqvist PG, Merlo l Low molecular weight heparin for repeated pregnancy loss: is it 
based on solid evidence? J Thromb Haemost. 2005;3:221-3. 
104. Lissak A, Sharon A, Fruchter O, Kassel A, Sanderovitz J, Abramovici H. Polymorphism 
for mutation of cytosine to thymine at location 677 in the methylenetetrahydrofolate 
reductase gen e is associated with recurrent early fetal loss. Am J Obstet Gynecol 
1999;181:126 -30. 
105. Łopaciuk S, Zawilska K, Torbicki A, Niżankowski R, Jaeschke R, Gajewski P, Bała M. 
Wytyczne profilaktyki i leczenia żylnej choroby zakrzepowo-zatorowej. Med Prakt. 
2002;5: 1-27. 
106. Łopaciuk S. Wrodzona trombofilia. W: Zakrzepy i zatory. Pod red. Łopaciuk S. 
Wydawnictwo Lekarskie PZWL Warszawa, 2002,65-88. 
107. Lucock M, Yates Z. Folic acid - vitamin and panacea or genetic time bomb? Nat Rev 
Genet. 2005;6:235-40. 
108. Lunghi B, Iacoviello L, Gemmati D, Dilasio MG, Castoldi E, Pinotti M, Castaman G, 
Redaelli R, Mariani G, Marchetti G, Bernardi F. Detection ofnew polymorphic markers 
in the factor V gene: association with factor V levels in plasma. Thromb Haemost. 
1996;75:45-8. 
109. Majerus PW. Human genetics. Bad blood by mutation. Nature. 1994;369: 14-5. 
110. Mansvelt EP, Laffan M, McVey JH, Tuddenham EG. Analysis of the F8 gene in 
individuals with high plasma factor VIII: C levels and associated venous thrombosis. 
Thromb Haemost. 1998;80:561-5. 
111. Mao R, Fan Y, Chen F, Fu S. Genetic polymorphism of MTHFR Gl793A in Chinese 
populations. Eur J Epidemiol. 2008;23 :363-8. 
112. Martinelli I, Taioli E, Cetin I, Marinoni A, Gerosa S, Villa MV, Bozzo M, Mannucci 
PM. Mutations in coagulation factors in women with unexplained late fetalloss. N Engl 
J Med. 2000;343:1015-8. 
113. Martinelli I, Battaglioli T, Tosetto A, Legnani C, Sottile L, Ghiotto R, Mannucci PM. 
Prothrombin Al991lG polymorphism and the risk of venous thromboembolism. J 
Thromb Haemost. 2006;4:2582-6. 
114. Matthews RG, Vanoni MA, Hainfeld JF, Wall l Methylenetetrahydrofolate reductase. 
Evidence for spatially distinct subunit domains obtained by scanning transmission 
e1ectron microscopy and limited proteolysis. J Biol Chem. 1984;259: 11647-50. 
115. McAlpine PJ, Coopland G, Guy C, James S, Komarnicki L, MacDonald M, Stranc L, 
Lewis M, Philipps S, Coghlan G, Kaita H, Cox DW, Guinto ER, MacGillivray R. 
Mapping the genes for erythrocytic alpha-spectrin l (SPTAI) and coagulation factor V 
(F5). Cytogenet. Cell Genet. 1989;51: 1042(abstract). 
116. Meinardi JR, Middeldorp S, de Kam PJ, Koopman MM, van Pampus EC, Hamulyak K, 
Prins MH, Bi.iller HR, van der Meer l Increased risk for fetalloss in carriers of the factor 
V Leiden mutation. Ann Intern Med. 1999; 130:736-9. 
117. Me10 SS, Persuhn DC, Meirelles MS, Jordao AA, Vannucchi H. Gl793A 
polymorphisms in the methylene-tetrahydrofolate gene: effect of folic acid on 
homocysteine levels. Mol Nutr Food Res. 2006;50:769-74. 
118. Mercier B, Oger E, Le Gal G, Mottier D, Ferec C.Phenotypic but not allelic ABO blood 
group association with risk ofvenous thrombosis.Thromb Haemost. 2005;93:388-9. 
119. Morelli VM, De Visser MC, Vos HL, Bertina RM, Rosendaal FR. ABO blood group 
genotypes and the risk of venous thrombosis: effect of factor V Leiden. J Thromb 
Haemost. 2005;3:183-5. 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 115 z 122
		

/p0116.djvu

			120. Mousa HA, Alfirevic Z. Do placentallesions reflect thrombophilia state in women with 
adverse pregnancy outcome? Hum Reprod. 2000; 15: 1830-3. 
121. Mtiraoui N, Zammiti W, Ghazouani L, Braham NJ, Saidi S, Finan RR, Almawi WY, 
Mahjoub T. Methylenetetrahydrofolate reductase C677T and Al298C polymorphism and 
changes in homocysteine concentrations in women with idiopathic recurrent pregnancy 
10sses.Reproduction. 2006; 131 :395-401. 
122. Mudd S. H, Skovby F, Levy HL, Pettigrew KD, Wilcken B, Pyeritz RE, Andria G, Boers 
GHJ, Bromberg IL, Cerone R, Fowler B, Grobe H, Schmidt H, Schweitzer L. The naturai 
history of homocystinuria due to cystathionine beta-synthase deficiency. Am J Hum 
Genet. 1985;37: 1-31. 
123. Munoz- Moran E, Dieguez- Lucena JL, Fernandez-Arras N, Peran-Mesa S, Reyes-Engel 
A. Genetic selection and folate intake during pregnancy. Lancet. 1998;352: 1120-1. 
124. Nelen WL, Steegers EA, Eskes TK, Biom Hl Genetic risk factor for unexplained 
recurrent early pregnancy loss. Lancet. 1997;350:861. 
125. Nelen WL, Biom ID, Steegers EA, den Heijer M, Eskes TK. Hyperhomocysteinemia and 
recurrent early pregnancy loss: a meta-analysis. Fertil Steril. 2000;74: 1196-9. 
126. Neumann AS, Lyons HJ, Shen H, Liu Z, Shi Q, Sturgis EM, Shete S, Spitz MR, EI- 
Naggar A, Hong WK, Wei Q. Methylenetetrahydrofolate reductase polymorphisms and 
risk of squamous cell carcinoma of the head and neck: a case-control analysis. Int J 
Cancer. 2005; 115: 131-6. 
127. Nicolaes GA, Dahlback B. Factor V and thrombotic disease: description of a janus-faced 
protein. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2002;22:530-8. 
128. Nossent AY, Eikenboom JC, Vos HL, Bakker E, Tanis BC, Doggen CJ, Bertina RM, 
Rosendaal FR. Haplotypes encoding the factor VIII 1241 Glu vari ati on, factor VIII 
levels and the risk ofvenous thrombosis. Thromb Haemost. 2006;95:942-8. 
129. Nybo AA, Wohlfahrt J, Christens P, Olsen J, Melbye M. Is maternal age an independent 
risk factor for fetalloss? West J Med. 2000;173:331. 
130. Padmanabhan R. Etiology, pathogenesis and prevention of neural tube defects. Congenit 
Anom (Kyoto). 2006;46:55-67. 
131. Patracchini P, Aiello V, Palazzi P, Calzolari E, Bernardi F. Sublocalization ofthe human 
protein C gen e on chromosome 2q13-qI4. Hum Genet. 1989;81:191-2. 
132. Pauer HU, Neesen J, Hinney B: Factor V Leiden and its relevance in patients with 
recurrent abortions. Am J Obstet Gynecol 1998; 178 :629. 
133. Perez-Ceballos E, Corral J, Alberca I, Vaya A, Llamas P, Montes R, Gonzalez-Conejero 
R, Vicente V. Prothrombin Al991lG and G20210A polymorphisms' role in thrombosis. 
Br J Haematol. 2002; 118:610-4. 
134. Picciano MP. Is homocysteine a biomarker for identifying women at risk of 
complications and adverse pregnancy outcomes? Am J Clin Nutr. 2000;71:857-8. 
135. Pickering W, Marriott K, Regan L. G20210A prothrombin gen e mutation: prevalence in 
a recurrent miscarriage population. Clin Appl Thromb Hemost. 2001;7:25-8. 
136. Pihusch R, Buchholz T, Lohse P, Riibsamen H, Rogenhofer N, Hasbargen U, Hiller E, 
Thaler Cl Thrombophilic gene mutations and recurrent spontaneous abortion: 
prothrombin increases the risk in the first trimester. Am J Reprod Immunol 
2001;46: 124-31. 
137. Poort SR, Rosendaal FR, Reitsma PH, Bertina RM. A common genetic variation in the 
3-prime-untranslated region of the prothrombin gene is associated with elevated plasma 
prothrombin levels and an increase in venous thrombosis. Blood 1996;88:3698-703. 
138. Preston FE, Rosendaal FR, Walker ID, Briet E, Berntorp E, Conard J, Fontcuberta J, 
Makris M, Mariani G, Noteboom W, Pabinger I, Legnani C, Scharrer I, Schulman S, van 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 116 z 122
		

/p0117.djvu

			der Meer Fl Increased fetal loss in women with heritable thrombophilia. Lancet. 
1996;348:913-6. 
139. Prochownik EV, Markham AP, Orkin SH. Isolation of a cDNA clone for human 
antithrombin III. J Biol Chem. 1983;258:8389-94. 
140. Proudfoot Nl Genetic dangers in poly(A) signals. EMBO Rep. 2001;2:891-2. 
141. Psuja P. Leczenie przeciwzakrzepowe. W:Leki w medycynie perinatalnej Pod red. 
Słomko Z, Bręborowicz GH, Gadzinowski l Ośrodek Wydawnictw Naukowych, Poznań 
1999,361-87. 
142. Quere I, Bellet H, Hoffet M, Janbon C, Mares P, Gris JC. A woman with five 
consecutive fetal deaths: case report and retrospective analysis ofhyperhomocysteinemia 
prevalence in 100 consecutive women with recurrent miscarriages. Fertil Steril 
1998;69: 152-4. 
143. Rady PL, Szucs S, Grady J, Hudnall SD, Kellner LH, Nitowsky H, Tyring SK, Matalon 
RK. Genetic polymorphisms of methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) and 
methionine synthase reductase (MTRR) in ethnic populations in Texas; a report of a 
novel MTHFR polymorphic site, G1793A. Am J Med Genet. 2002; 107: 162-8. 
144. Rai RS, Regan L, Chitolie A, Donald JG, Cohen H. Placental thrombosis and second 
trimester miscarriage in association with activated protein C resistance. Br J Obstet 
Gynaecol. 1996;103:842-4. 
145. Rai R, Backos M, Baxter N, Chilcott I, Regan L. Recurrent miscarriage--an aspirin a 
day? Hum Reprod. 2000; 15 :2220-3. 
146. Rai R. Is miscarriage a coagulopathy? Curr Opin Obstet Gynecol. 2003 ; 15 :265-8. 
147. Rai R, Regan L. Recurrent miscarriage. Lancet. 2006;368:601-11. 
148. Rasch Y. Cigarette, alcohol, and caffeine consumption: risk factors for spontaneous 
abortion. Acta Obstet Gynecol Scand. 2003;82:182-8. 
149. Raziel A, Kornberg Y, Friedler S, Schachter M, Sela BA, Ron-EI R. Hypercoagulable 
thrombophilic defects and hyperhomocysteinemia in patients with recurrent pregnancy 
loss. Am J Reprod Immunol. 2001;45:65-71. 
150. Rees DC. The population genetics of factor V Leiden (Arg506Gln). Br J Haematol. 
1996;95:579-86. 
151. Rekomendacje Polskiego Towarzystwa Ginekologicznego w zakresie wybranych 
patologii wczesnej ciąży oraz postępowania w ciąży po zapłodnieniu żn vżtro. 
Ginekologia po dyplomie. Wydanie specjalne. Grudzień 2005: 36-41. 
152. Rekomendacje Polskiego Towarzystwa Ginekologicznego w zakresie wybranych 
patologii wczesnej ciąży oraz postępowania w ciąży po zapłodnieniu żn vżtro. 
Ginekologia po dyplomie. Wydanie specjalne. Luty 2008: 208-12. 
153. Ren A, Wang l Methylenetetrahydrofolate reductase C677T polymorphism and the risk 
ofunexplained recurrent pregnancy loss: a meta-analysis. Fertil Steril. 2006;86: 1716-22. 
154. Reznikoff-Etievant M, Cayol V, Carbonne B, Robert A, Coulet F, Milliez l Factor V 
Leiden and G20210A prothrombin mutations are risk factors for very early recurrent 
miscarriage. BJOG. 2001;108:1251-4. 
155. Ridker PM, Miletich JP, Buring JE, Ariyo AA, Price DT, Manson JE, Hill JA. Factor V 
Leiden mutation as a risk factor for recurrent pregnancy loss. Ann Intern Med 1998; 
128: 1000-3. 
156. Roberts CJ, Lowe CR. Where have all the conceptions gone? Lancet 1975;1:498-9. 
157. Roelse JC, Koopman MM, Bi.iller HR, ten Cate JW, Montaruli B, van Mourik JA, 
V oorbert l Absence of mutations at the activated protein C cleavage sites of factor VIII 
in 125 patients with venous thrombosis. Br J Haematol. 1996;92:740-3. 
158. Roque H, Paidas MJ, Funai EF, Kuczynski E, Lockwood Cl Maternal thrombophilias 
are not associated with early pregnancy loss. Thromb Haemost. 2004;91 :290-5. 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 117 z 122
		

/p0118.djvu

			159. Rosendaal FR, Koster T, Vandenbroucke JP, Reitsma PH. High risk of thrombosis in 
patients homozygous for factor V Leiden (activated protein C resistance). Blood. 
1995;85: 1504-8. 
160. Rosendaal FR, Siscovick DS, Schwartz SM, Psaty BM, Raghunathan TE, Vos HL: A 
common prothrombin variant (20210 G to A) increases the risk of myocardial infarction 
in young women. Blood. 1997;90: 1747-50. 
161. Rosendaal FR, Doggen CJ, Zivelin A, Arruda VR, Aiach M, Siscovick DS, Hillarp A, 
Watzke RH, Bernardi F, Cumming AM, Preston FE, Reitsma PH. Geographic 
distribution ofthe 20210 G to A prothrombin variant. Thromb Haemost. 1998;79:706-8. 
162. Sadewa AR, Sutomo R, Istiadjid M, Nishiyama K, Shirakawa T, Matsuo M, Nishio H. 
C677T mutation in the MTHFR gene was not found in patients with frontoethmoidal 
encephalocele in East Java, Indonesia. Pediatr Int. 2004;46:409-14. 
163. Sanson BJ, Simioni P, Tormene D, Moia M, Friederich PW, Huisman MV, Prandoni P, 
Bura A, Rejto L, Wells P, Mannucci PM, Girolami A, Bi.iller HR, Prins MH. The 
incidence of venous thromboembolism in asymptomatic carriers of a deficiency of 
antithrombin, protein C, or protein S: a prospective cohort study. Blood. 1999;94:3702-6. 
164. Scanavini D, Legnani C, Lunghi B, Mingozzi F, Palareti G, Bernardi F. The factor VIII 
Dl24lE polymorphism is associated with decreased factor VIII activity and not with 
activated protein C resistance levels. Thromb Haemost. 2005;93 :453-6. 
165. SchleefM, Strobel E, Dick A, Frank J, Schramm W, Spannagl M. Relationship between 
ABO and Secretor genotype with plasma levels of factor VIII and von Willebrand factor 
in thrombosis patients and control individuals. Br J Haematol. 2005; 128: 100-7. 
166. Sebire NJ, Jolly M, Harris JP, Wadsworth J, Joffe M, Beard RW, Regan L, Robinson S. 
Maternal obesity and pregnancy outcome: a study of287,213 pregnancies in London. Int 
J Obes Relat Metab Disord. 2001;25: 1175-82. 
167. Sheets MD, Ogg SC, Wickens MP. Point mutations in AAUAAA and the poly (A) 
addition site: effects on the accuracy and efficiency of c1eavage and polyadenylation in 
vitro. Nuc1eic Acids Res. 1990;18:5799-805. 
168. Shi Q, Zhang Z, Li G, Pillow PC, Hernandez LM, Spitz MR, Wei Q. Sex differences in 
risk of1ung cancer associated with methylene-tetrahydrofolate reductase polymorphisms. 
Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 2005; 14: 1477-84. 
169. Sikkema JM, Franx A, Bruinse HW, van der Wijk NG, de Valk HW, Nikkels PG. 
Placental pathology in early onset pre-ec1ampsia and intra-uterine growth restriction in 
women with and without thrombophilia. Placenta. 2002;23:337-42. 
170. Skrzypczak l Poronienie. W: Położnictwo i ginekologia. Pod red. Bręborowicz GH. 
Wydawnictwo Lekarskie PZWL Warszawa 2005; 111-9. 
171. Skrzypczak l Poronienie. W: Ciąża wysokiego ryzyka. Pod red. Bręborowicz GH. 
Ośrodek Wydawnictw Naukowych, Poznań 2006;81-104. 
172. Skrzypczak l Czy heparyna podawana w okresie ciąży zapobiega zdarzeniom 
niepożądanym związanym z dziedzicznę skłonnością do zakrzepicy? Komentarz. 
Ginekol Dypl. 2008;10:82-7. 
173. Słomski R, Jura J, Kalak R, Szalata M, W olko Ł, W olko B, Wielgus K, Kowalska K. 
Izolacja DNA. W: Przykłady analiz DNA. Pod red. Słomski R. Wydawnictwo Akademii 
Rolniczej im. A. Cieszkowskiego w Poznaniu, 2004; 21-31. 
174. Sood R, Zogg M, Westrick RJ, Guo YH, Kerschen EJ, Girardi G, Salmon JE, Coughlin 
SR, Weiler H. Fetal gene defects precipitate platelet-mediated pregnancy failure in factor 
V Leiden mothers. J Exp Med. 2007;204: 1049-56. 
175. Souza SS, Ferriani RA, Pontes AG, Zago MA, Franco RP. Factor V leiden and factor II 
G20210A mutations in patients with recurrent abortion. Hum Reprod. 1999; 14:2448-50. 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 118 z 122
		

/p0119.djvu

			176. Stanger O, Herrmann W, Pietrzik K, Fowler B, Geisel J, Dierkes J, Weger M; DACH- 
LIGA Homocystein e.Y. DACH-LIGA homocystein (german, austrian and swiss 
homocysteine society): consensus paper on the rational c1inical use of homocysteine, 
folic acid and B-vitamins in cardiovascular and thrombotic diseases: guidelines and 
recommendations. Clin Chem Lab Med. 2003;41:1392-403. 
177. Steegers-Theunissen RP, Boers GH, Trijbels FJ, Finkeistein JD, Biom HJ, Thomas CM, 
Borm GF, W outers MG, Eskes TK. Maternal hyperhomocysteinemia: a risk factor for 
neural-tube defects? Metabolism. 1994;43: 1475-80. 
178. Steegers-Theunissen RP, Wathen NC, Eskes TK Van Raaij-Selten B, Chaed T. Materna 
and fetallevels of methionine and homocysteine in early human pregnancy. Br J Obst 
Gynaecol. 1997; 104 :20-4. 
179. Stirling Y, Woolf L, North WR, Seghatchian MJ, Meade TW. Haemostasis in normal 
pregnancy. Thromb Haemost. 1984;52: 176-82. 
180. Subrt I, Ulcova-Gallova Z, Bibkova K, Micanova Z, Hejnalova M, Cerna M, Hradecky 
L, Novotny Z. Recurrent pregnancy loss and frequency of eight antiphospholipid 
antibodies and genetic thrombophilic factors in Czech women. Am J Reprod Immunol. 
2008;59: 193-200. 
181. Tallova J, Tomandl J, Bicikova M, Hill M. Changes of plasma total homocysteine levels 
during the menstrual cyc1e. Eur J Clin Invest. 1999,29: 1041-4. 
182. Tirado I, Mateo J, Soria JM, Oliver A, Martinez-Sanchez E, Vallve C, Borrell M, Urrutia 
T, Fontcuberta l The ABO blood group genotyp e and factor VIII levels as independent 
risk factors for venous thromboembolism. Thromb Haemost. 2005;93 :468-74. 
183. Tirado I, Soria JM, Mateo J, Oliver A, Souto JC, Santamaria A, Felices R, Borrell M, 
Fontcuberta lAssociation after linkage analysis indicates that homozygosity for the 46C- 
->T polymorphism in the Fl2 gene is a genetic risk factor for venous thrombosis. 
Thromb Haemost. 2004;91 :899-904. 
184. Tormene D, Simioni P, Prandoni P, Luni S, Innella B, Sabbion P, Girolami A. The risk 
of fetal loss in family members of probands with factor V Leiden mutation. Thromb 
Haemost 1999; 82: 1237-9. 
185. Tulppala M, Viinikka L, Ylikorkala O. Thromboxane dominance and prostacyc1in 
deficiency in habitual abortion. Lancet. 1991;337:879-81. 
186. Uszyński M. Krążenie maciczno-łożyskowe i łożyskowe komponenty krzepnięcia. W: 
Klasyczne i nowo poznane koagulopatie położnicze. Wydawnictwo Medyczne Urban & 
Partner. 2003; 14-21 
187. Van Boven RH, Lane DA. Antithrombin and its inherited deficiency states. Semin 
Hematol. 1997;34: 188-204. 
188. Van der Put NM, Gabreels F, Stevens EM, Smeitink JA, Trijbels FJ, Eskes TK, van den 
Heuvel LP, Biom Hl A second common mutation in the methylenetetrahydrofolate 
reductase gene: an additional risk factor for neural-tube defects? Am J Hum Genet. 
1998;62: 1044-51. 
189. Van Dunne FM, de Craen AJ, Heijmans BT, Helmerhorst FM, Westendorp RG. Gender- 
specific association of the factor V Leiden mutation with fertility and fecundity in a 
historic cohort. The Leiden 85-Plus Study. Hum Reprod. 2006;21:967-71. 
190. Vilaseca MA, Moyano D, Ferrer I, Artuch R. Total homocysteine in pediatric patients. 
Clin Chem. 1997;43:690-2. 
191. Vos HL. Inherited defects of coagulation Factor V: the thrombotic side. J Thromb 
Haemost. 2006;4:35-40. 
192. Vossen CY, Rosendaal FR. The protective effect of the factor XIII Val34Leu mutation 
on the risk of deep venous thrombosis is dependent on the fibrinogen level. J Thromb 
Haemost. 2005;3:1102-3. 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 119 z 122
		

/p0120.djvu

			193. Walker ID, Kujovich JL, Greer lA, Rey E, David M, Salmon JE, Hunt BJ, Zotz RB, 
Gerhardt A, Scharf RE, Middeldorf S, MartineUi I, Cetin I, Grandone E. The use of 
LMWH in pregnancies at risk: new evidence or perception? J Thromb Haemost. 
2005;3:778-93. 
194. Walker MC, Smith GN, Perkins SL, Keely EJ, Garner PR. Changes in homocysteine 
levels during normai pregnancy. Am J Obstet Gynecol. 1999; 180:660-4. 
195. Weisberg I, Tran P, Christensen B, Sibani S, Rozen R. A second genetic polymorphism 
in methylenetetrahydrofolate reductese (MTHFR) associated with decreased enzym e 
activity. Mol Genet Metabol. 1998;64: 169-172. 
196. Weisberg IS, Jacques PF, Selhub J, Bostom AG, Chen Z, Curtis EUison R, Eckfeldt JH, 
Rozen R. The 1298A-->C polymorphism in methylenetetrahydrofolate reductase 
(MTHFR): in vitro expression and association with homocysteine. AtheroscIerosis. 
2001; 156:409-15. 
197. WeUs PS, Anderson JL, Scarvelis DK, Doucette SP, Gagnon F. Factor XIII Val34Leu 
variant is protective against venous thromboembolism: a HuGE review and meta- 
analysis. Am J Epidemiol. 2006;164:101-9. 
198. Winkelmayer WC, Huber A, Wagner OF, Harl WH, Sunder-Plassmann G, Fadinger M. 
Associations between MTHFR 1793G>A and plasma total homocysteine, folate, and 
vitamin B in kidney transplant recipients. Kidney Int. 2005;67: 1980-5. 
199. Wouters MG, Boers GH, Biom ID, Trijbels FJ, Thomas CM, Borm GF, Steegers- 
Theunissen RP, Eskes TK. Hyperhomocysteinemia: a risk factor in women with 
unexplained recurrent early pregnancy loss. Fertil Steril. 1993;60:820-5. 
200. Wramsby ML, Sten-Linder M, Bremme K. Primary habitual abortions are associated 
with high frequency offactor V Leiden mutation. Fertil Steril. 2000;74:987-91. 
201. Wright JG, Cooper P, Astedt B, Lecander I, Wilde JT, Preston FE, Greaves M. 
Fibrinolysis during norm al human pregnancy: complex inter-relationships between 
plasma levels of tissue plasminogen activator and inhibitors and the euglobulin cIot lysis 
time. Br J Haematol. 1988;69:253-8. 
202. Xu WH, Shrubsole MJ, Xiang YB, Cai Q, Zhao GM, Ruan ZX, Cheng JR, Zheng W, 
Shu XO. Dietary folate intake, MTHFR genetic polymorphisms, and the risk of 
endometrial cancer among Chinese women. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 
2007; 16:281-7. 
203. Yamada K, Chen Z, Rozen R, Matthews RG. Effects of common polymorphisms on the 
properties of recombinant human methylenetetrahydrofolate reductase. Proc Nat Acad 
Sci. 2001;98: 14853-8. 
204. Y ounis JS, Brenner B, Oh el G, Tal J, Lanir N, Ben Ami M. Activated protein C 
resistance and factor V Leiden mutation can be associated with first-as weU as second 
trimester recurrent pregnancy loss. Am J Reprod Immunol. 2000; 43:31-5. 
205. Zdrojewski T, Bandosz P, Szpakowski P, Konarski R, Manikowski A, Wołkiewicz E, 
Jakubowski Z, Łysiak-Szydłowska W, B autemb ach S, Wyrzykowski B. 
Rozpowszechnienie głównych czynników ryzyka chorób układu sercowo-naczyniowego 
w Polsce. Wyniki badania NATPOL PLUS. Kardiol Pol. 2004; 61: 1-26. 
206. Zetterberg H, Regland B, Palmer M, Ricksten A, Palmqvist L, Rymo L, Arvanitis DA, 
Spandidos DA, Blennow K. Increased frequency of combined methylenetetrahydrofolate 
reductase C677T and A1298C mutated aUe1es in spontaneously aborted embryos. Eur J 
Hum Genet. 2002; 10: 113-8. 
207. Zivelin A, Mor-Cohen R, Kovalsky V, Kornbrot N, Conard J, Peyvandi F, Kyrle PA, 
Bertina R, Peyvandi F, Emmerich J, Seligsohn U. Prothrombin 20210G>A is an 
ancestral prothrombotic mutation that occurred in whites approximately 24,000 years 
ago. Blood. 2006;107:4666-8. 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 120 z 122
		

/p0121.djvu

			10. SPIS TABEL, RYCIN I FOTOGRAFII 


Tabela 1. Naj częstsze wymieniane przyczyny trombofilii wrodzonej. 
Tabela 2. Dane kliniczne pacjentek z grup badanej (104 osoby) i kontrolnej (169 osób). 
Tabela 3. Charakterystyka badanych polimorfizmów. 
Tabela 4. Startery użyte do reakcji PCR. 
Tabela 5. Wielkości fragmentów po reakcji hydrolizy oraz stosowane enzymy restrykcyjne 
przy oznaczeniu polimorfizmów genetycznych badanych genów. 
Tabela 6. Częstość występowania genotypów i aUe1i polimorfizmu 1691G>A czynnika V w 
grupie badanej z poronieniami oraz w grupie kontrolnej. 
Tabela 7. Częstość występowania poszczególnych genotypów i aUe1i polimorfizmu 20210 
G>A czynnika II w grupie badanej z poronieniami oraz w grupie kontrolnej. 
Tabela 8. Częstość występowania poszczególnych genotypów i aUe1i polimorfizmu 677C> T 
MTHFR w grupie badanej z poronieniami oraz w grupie kontrolnej. 
Tabela 9. Częstość występowania poszczególnych genotypów i aUe1i polimorfizmu 
1298A>C MTHFR w grupie badanej z poronieniami oraz w grupie kontrolnej. 
Tabela 10. Częstość występowania poszczególnych genotypów i aUe1i polimorfizmu 
1793G> A MTHFR w grupie badanej z poronieniami oraz w grupie kontrolnej. 
Tabela 11. Częstość występowania poszczególnych genotypów i aUe1i polimorfizmu 
1691 G> A czynnika V w grupie badanej z dwoma, trzema i więcej oraz grupie kontrolnej. 
Tabela 12. Częstość występowania poszczególnych genotypów i aUe1i polimorfizmu 
20210G>A czynnika II w grupie badanej z dwoma, trzema i więcej oraz grupie kontrolnej. 
Tabela 13. Częstość występowania poszczególnych genotypów i aUe1i polimorfizmu 
677C>T MTHFR w grupie badanej z dwoma, trzema i więcej oraz grupie kontrolnej. 
Tabela 14. Częstość występowania poszczególnych genotypów i aUe1i polimorfizmu 
1298A>C MTHFR w grupie badanej z dwoma, trzema i więcej oraz grupie kontrolnej. 
Tabela 15. Częstość występowania poszczególnych genotypów i aUe1i polimorfizmu 
1793G> A MTHFR w grupie badanej z dwoma, trzema i więcej oraz grupie kontrolnej. 
Tabela 16. Częstość występowania poszczególnych genotypów i aUe1i polimorfizmów 
1691G>A i 20210G>A w podgrupach 
Tabela 17. Częstość występowania poszczególnych genotypów i aUe1i polimorfizmów 
677C>T, 1298A>C i 1793G>A genu reduktazy metylenotetrahydrofolianowej w 
podgrupach. 
Tabela 18. Współwystępowanie genotypów 1691G>A czynnika V oraz 20210G>A genu 
protrombiny między całą grupą badaną kobiet z poronieniami oraz grupą kontrolną. 
Tabela 19. Współwystępowanie genotypów 677C>T oraz 1298A>C genu MTHFR między 
całą grupą badaną kobiet z poronieniami oraz grupą kontrolną. 
Tabela 20. Współwystępowanie genotypów 1298A>C oraz 1793G>A genuMTHFR między 
całą grupą badaną kobiet z poronieniami oraz grupą kontrolną. 
Tabela 21. Współwystępowanie genotypów 677C>T oraz 1793G>A genu MTHFR między 
całą grupą badaną kobiet z poronieniami oraz grupą kontrolną. 
Tabela 22. Ocena częstości występowania poszczególnych haplotypów badanych 
polimorfizmów genu MTHFR dokonana za pomocą programu PRASE. 
Tabela 23. Badania potwierdzające związek pomiędzy mutacją czynnika V Leiden i 
. o. o. 
poromemaml nawracającymI. 
Tabela 24. Badania nie potwierdzające związku pomiędzy mutacją czynnika V Leiden i 
. o. o. 
poromemaml nawracającymI. 
Tabela 25. Częstość występowania polimorfizmu 20210G>A genu protrombiny w grupie 
badanej z poronieniami nawracaj ącymi i kontrolnej. 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 121 z 122
		

/p0122.djvu

			Tabela 26. Klasyfikacja stężenia homocysteiny w osoczu krwi 
Tabela 27. Populacje narażone na ryzyko podwyższonego poziomu Hcy 
Tabela 28. Częstość występowania hiperhomocysteinemii (%) w populacji dorosłych 
Polaków 
Tabela 29 . Częstość występowania aUe1i wybranych polimorfizmów genu MTHFR w 
różnych populacj ach 
Tabela 30. Częstość występowania polimorfizmu 677C>T genu MTHFR w grupie kobiet z 
poronieniami nawracaj ącymi i kontrolnej. 
Tabela 31. Geny mogące wpływać na rozwój zakrzepicy żylnej 
Tabela 32. Postępowanie u kobiet ciężarnych zagrożonych utratą ciąży wg wytycznych 
profilaktyki i leczenia żylnej choroby zakrzepowo-zatorowej (2002) 


Ryc.l. Schemat kaskady krzepnięcia krwi (A) i układu fibrynolitycznego (B) oraz 
najczęściej występujące mutacje prozakrzepowe 
Ryc. 2. Rozkład czynnika V prawidłowego i z mutacją Leiden 
Ryc. 3. Schemat lokalizacji sygnału poliCA) w pre-mRNA protrombiny wraz z związanymi 
czynnikami cięcia i poliadenylacji 
RycA. Schemat przemian metabolicznych homocysteiny 
Ryc. 5. Redukcja 5,10-metylenotetrahydrofolian do 5-metylotetrahydrofolianu z udziałem 
NADPH 
Ryc. 6. Schemat lokalizacji na chromosomie, budowy białka i genu oraz rozmieszczenia 
naj ważniej szych polimorfizmów reduktazy metylenotetrahydrofolianowej. 
Ryc. 7. Profil termiczny i czas reakcji PCR dla polimorfizmu 20210G>A protrombiny. 
Ryc. 8. Częstość występowania haplotypów polimorfizmów MTHFR 
Ryc.9. Zakres niepomyślnych zakończeń ciąży 
Ryc. 10. Zmiany stężenia homocysteiny podczas ciąży 
Ryc.H. Model mechanizmu genetycznej selekcji oparty na wzajemnej interakcji pomiędzy 
folianami i wariantem polimorficznym 677C> T genu MTHFR. 
Ryc.12. Mechanizm działania leków przeciwzakrzepowych na układ hemostazy 


Fot. 1. Analiza genotypów polimorfizmu 1691G>A czynnika V (mutacja Leiden) po 
hydrolizie enzymem restrykcyjnym MnlI. 
Fot.2. Analiza genotypów polimorfizmu 20210G>A czynnika II po hydrolizie enzymem 
restrykcyjnym HżndIII. 
Fot.3. Analiza genotypów polimorfizmu 677C>T MTHFR po hydrolizie enzymem 
restrykcyjnym Hżnjl. 
FotA. Analiza genotypów polimorfizmu 1298A>C MTHFR po hydrolizie enzymem 
restrykcyjnym MboII. 
Fot.5. Analiza genotypów polimorfizmu 1793G>A MTHFR po hydrolizie enzymem 
restrykcyjnym MbżI (BsrBI). 


Rozprawa doktorska - Grażyna Kurzawińska 


Strona 122 z 122